初情期启动过程中小尾寒羊下丘脑GnRH基因甲基化状态及表达量关系研究

丁 赫 ，宫永胜，王 军，吕文发

（吉林农业大学动物科技学院，吉林省反刍动物繁育生物技术与健康养殖工程实验室，吉林长春 130118）

初情期是指雌性动物初次发情并排出卵子的过程，是动物获得繁殖能力的标志，其启动时间的早晚影响着养羊业的经济效益[1-2]。下丘脑-垂体-性腺（Hypothalamic-Pituitary-Gonadal，HPG）轴在初情期启动过程中具有重要的作用，下丘脑促性腺激素释放激素（Gonadotropin-releasing Hormone，GnRH）脉冲式释放，调节垂体促卵泡素和促黄体素的分泌，最终实现初情期的启动[3-4]。初情期启动的机制复杂，主要与环境、表观遗传机制等密切相关。DNA甲基化是目前研究较多的一种表观遗传修饰方式，多发生在富含CpG岛和CpG位点区域，启动子区甲基化状态影响着基因的转录[5-7]。有研究表明，DNA甲基化升高可抑制基因的表达[8-9]，在初情期启动过程中DNA甲基化改变可能影响下丘脑中的特定基因的表达，从而调节初情期的启动[10-11]。本实验利用亚硫酸氢盐测序（Bisulfite Sequencing PCR，BSP）技术研究了GnRH启动子区富含CpG岛和CpG位点的1 000 bp区域的甲基化状态，通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术研究了GnRHmRNA表达量，并分析初情期启动过程中小尾寒羊下丘脑GnRH基因表达与其启动子区甲基化状态的关系。

1 材料与方法

1.1 样品采集与保存 采集初情期前（90日龄）、临近初情期（120日龄）、初情期（130日龄）小尾寒羊的下丘脑组织，每个阶段选取小尾寒羊3只，采集的下丘脑样本为前端止于视交叉，后端止于乳头体，样品采集做好标记后，放入液氮中保存，待取样结束全部置入-80℃冰箱中保存。

1.2 BSP测序 取组织样品，利用DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，中国）按说明书操作进行基因组DNA提取，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，用NAS-99测定样品中DNA浓度。随后根据样品浓度，抽取500 μg DNA进行DNA亚硫酸氢盐修饰，根据试剂盒EZ DNA Methylation-Gold Kit（ZYMO公司catlog D5006）进行具体操作。在Ensembl（http://asia.ensembl.org/index.html）上查找并下载GnRH启动子序列，将序列在在线引物设计软件methprimer（http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi） 中转化为亚硫酸氢盐修饰后的序列，利用软件Primer5设计GnRH启动子甲基化位点扩增引物，引物序列送至北京优博兰基因技术有限公司进行合成，引物信息见表1。PCR扩增体系半巢式第1轮：1 μL修饰后DNA模板，1 μLGnRH-F（10 μmol/L），1 μLGnRH-OR（10 μmol/L），0.5 μL dNTP（10 mmol/L），1 μL Mg2+（50 mmol/L），2.5 μL 10×PCR Buffer，0.1 μL Taq酶，ddH2O至25 μL。半巢式第2轮：1 μL 第 1 轮 PCR 产物，1 μLGnRH-F（10 μmol/L），1 μLGnRH-R（10 μmol/L），0.5 μL dNTP（10 mmol/L），1 μL Mg2+（50 mmol/L），2.5 μL 10×PCR Buffer，0.1 μL Taq酶，ddH2O至25 μL，使用Taq酶Platinum®Taq DNA Polymerase, High Fidelity（Thermocatlog11304-029）进行扩增。半巢式第1轮扩增程序：94℃ 2 min，94℃ 30 s、57℃ 30 s、72℃ 40 s、30个 循 环，72℃延伸5 min。半巢式第2轮扩增程序为：94℃ 2 min，94℃ 30 s、60℃ 降 到 53℃（ 每 个 循 环 降 1℃）30 s、72℃ 30 s、7 个循环，94℃ 30 s、50℃ 30 s、72℃ 30 s、33个循环，72℃延伸5 min。PCR产物经2%琼脂糖检测后，切胶，使用DNA纯化回收试剂盒（天根生化科技有限公司，DP209-03）纯化产物。利用P-Easy T1 Cloning载体连接试剂盒（北京全式金生物技术有限公司CT101-02）进行连接转化。利用试剂盒（Omega bio-tek，美国）提取质粒，将质粒每段序列至少选择10个，送至北京优博兰基因技术有限公司进行测序，利用BiQ Analyzer对测序结果进行整理并分析甲基化状态，每个基因甲基化程度以所测得的CpG位点的甲基化数占所测的甲基化位点总数的百分率表示。

1.3 实时荧光定量PCR检测 采用Trizol法提取下丘脑组织的总RNA，取冷冻保存的下丘脑，提取脑组织总RNA进行反转录为cDNA，用于实时荧光定量PCR实验， 根据TaKaRa的反转录试剂盒要求，利用RNA的OD值计算反转20 μL的cDNA所需的RNA量。本实验所需的GnRH基因引物序列见表2。引物序列利用Prime 5.0自行设计，由上海生工生物技术有限公司合成，并利用PCR仪进行引物验证，摸索引物的最适反应条件。利用荧光定量PCR仪对初情期前、临近初情期和初情期母羊下丘脑中GnRH基因进行定量分析，反应体系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL、Forward primer 0.8 μL、Reverse primer 0.8 μL、ROX reference DyeⅡ 0.4 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 至 20 μL。反应条件：95℃ 预变性 30 s；95℃ 变性 5 s，40 个循环；57℃ 退火34 s，扩增40个循环；95℃ 变性15 s，57℃ 退火60 s，95℃ 变性 15 s。

1.4 统计分析 采用SPSS17.5 软件进行χ2检验比较组间差异性，数据用平均值±标准差表示，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 初情期启动过程中甲基化状态 利用BiQ Analyzer对测序结果进行整理分析，得到GnRH启动子区靠近第1外显子1 000 bp内4个CpG位点甲基化状态结果，将得到的结果绘制成空点图（图1-A）和柱状图（图1-B）。结果表明，在初情期前到临近初情期，甲基化状态变化不明显（P＞0.05）；当到达初情期时，GnRH启动子所检测区域总体甲基化水平呈降低趋势，初情期甲基化水平达33.33%，与初情期前差异极显著（P＜0.01）。随着初情期的到来，在GnRH启动子区-570位点，甲基化程度显著降低（P＜0.01）。这些结果表明，初情期启动过程中GnRH启动子区特定位点的甲基化水平显著降低。

表1 甲基化位点扩增引物序列

表2 基因引物合成情况

图 1 GnRH 基因启动子区域甲基化状态

2.2 初情期启动过程GnRH基因表达量 如图2所示，熔解曲线呈单一峰值，且峰尖而窄，未出现杂峰，说明扩增较好。由图3可知，随着初情期的启动，GnRHmRNA表达量在下丘脑中呈上升趋势，GnRH在初情期的 mRNA表达量与其余2个时期差异极显著（P＜0.01）。结合GnRH甲基化结果发现，随着初情期的到来，GnRH甲基化呈降低趋势，并伴随着GnRHmRNA表达量升高。

图2 GnRH的熔解曲线

3 讨 论

图3 GnRH的mRNA表达量

近年来，研究甲基化与基因表达量关系的报道越来越多。启动子区CpG位点甲基化可抑制转录因子与启动子的结合，从而抑制基因的表达。CpG位点可以通过改变甲基化状态调节基因转录[7,12-13]。Lomniczi等[14]向雌性小鼠注射DNA甲基化酶抑制剂（5-AZA），发现实验组阴道口开启的时间较对照组显著延迟，同时延迟了卵巢的成熟，说明向雌性小鼠体内注射5-AZA抑制甲基化时，初情期启动受到抑制。而Terasawa等[15]研究猕猴GnRH神经元细胞成熟过程中表观遗传学的变化，发现mRNA表达量上升的同时GnRH基因5'端CpG岛甲基化呈降低趋势。同样，Kurian等[16]通过体外培养GnRH神经元发现，在体外成熟的过程中GnRHmRNA表达量显著上升，同时GnRH5'端14个CpG位点中有8个位点甲基化水平显著下降。GnRH甲基化状态与mRNA表达量变化趋势与本研究结果一致。通过利用免疫荧光双标记技术研究发现，甲基化CpG结合蛋白（MeCP2）和GnRH在母羊下丘脑视前区和弓状核中存在共表达，且共表达阳性细胞数在初情期显著高于初情期前和临近初情期，说明DNA甲基化对GnRH表达可能存在一定的影响[17]。最近宫永胜研究发现，DNA甲基转移酶 1（Dnmt 1）和GnRH在下丘脑视前区和弓状核均有表达，同样呈现共表达模式（未发表数据）。这些研究进一步说明了GnRH甲基化程度可能会影响着GnRHmRNA表达量，最终影响母羊初情期的启动。

本研究对初情期启动过程中小尾寒羊下丘脑GnRH表达量变化与其启动子区甲基化状态相关性进行了初步研究，其对初情期启动的作用机制尚需进一步研究。

母羊初情期启动过程中GnRH表达调控机制目前尚不清楚，DNA甲基化作为一种重要的基因表达调控方式，可能通过影响GnRH表达来调控母羊初情期的启动。本研究结果显示，随着小尾寒羊初情期的启动，GnRH基因mRNA表达量呈上升趋势，同时GnRH启动子区甲基化水平降低，由此可知小尾寒羊下丘脑中GnRH甲基化状态与其基因表达量及初情期启动有一定的关系。

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