牛传染性鼻气管炎病毒LAMP检测方法的建立

高 峰，王建峰，于伯华，张 丹，刘向阳，张 琳，秦志军，唐泰山

（1. 盐城出入境检验检疫局，江苏盐城 224002；2. 宁波检验检疫科学技术研究院，浙江宁波 315100；3. 江苏出入境检验检疫局，江苏南京 210001）

牛传染性鼻气管炎（IBR）是由牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）引起牛的一种急性、热性、接触性传染病，以鼻气管炎、眼结膜炎、高热、流产、传染性脓疱性外阴道炎为主要特征[1]，为世界动物卫生组织（OIE）法定报告动物疫病。IBRV可通过空气、媒介物，以及与病牛直接接触传播，20～60日龄犊牛对其最易感，对6周龄以下犊牛的病死率可达85%～100%[2]。目前针对IBR的病原学检测有包涵体检查、病毒分离、PCR、qPCR和荧光定量PCR等[3]；血清学诊断方法有中和试验、琼脂扩散试验、间接血凝试验、ELISA试验和变态试验等[4]。但这些方法不是操作繁琐，就是需要高昂的设备和试剂。环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal ampli fi cation，LAMP）是一种新型的核酸等温扩增技术，最早由日本 Notomi 等[5]报道，具有条件简单、操作方便等突出优点，是近年来发展起来的一种快速临床疾病诊断方法[6]。与其它分子生物学方法相比，LAMP 具有方便、简捷、灵敏等优点。本研究以IBRV为研究对象，基于LAMP技术，建立了可视化LAMP检测方法，有效缩短了检测时间，加快了通关速度，便于口岸、基层等特殊场所动物疫病检测的开展。

1 材料与方法

1.1 病毒株

牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）、蓝舌病病毒、赤羽病病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛白血病病毒、小反刍兽疫病毒和伪狂犬病病毒，由江苏出入境检验检疫局动检实验室提供。

1.2 主要试剂、仪器及耗材

病毒株病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒（货号DP315）、 DNA纯化回收试剂盒（货号DP214-02）：购自天根生化科技（北京）有限公司；反转录试剂盒（D2680A）：购自TaKaRa公司。其他：甜菜碱（Sigma 公司）、Bst DNA大片段扩增酶（NEB公司）、SYBR Green I（Invitrigen 公司）

1.3 LAMP引物设计及合成

根据GenBank中发表的IBRV全基因序列，利用MEGA 3.1进行同源性比对；选择基因中的高保守区域，采用Primer explorer V4网上在线软件（http∶//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html） 设计3对针对靶基因的引物，包括2条外引物F3和B3、2条内引物FIP和BIP，以及引物LF和LB。引物序列如表1所示。

表1 RT-LAMP引物序列

1.4 病毒核酸提取及反转录

RNA和DNA病毒核酸的提取，参照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书进行。其中对RNA，再利用反转录试剂盒，将RNA反转录为cDNA，-20 ℃ 保存。

1.5 LAMP检测体系优化

在LAMP基本反应体系基础上设置不同内引物浓度（0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、2.4 µmol/L），dNTP 浓度（0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4、2.0和2.4 mmol/L），Mg2+浓度（2、4、6、8、10和12 mmol/L）和反应温度（45、50、55、57、60、63、65、67和70 ℃），然后分别进行单因素实验，探索各因素对LAMP的影响，获得最佳反应参数。

1.6 LAMP 灵敏性试验

提取IBRV核酸，按照107～100copies/µL进行10倍比梯度稀释；以此为模板分别进行LAMP扩增，分析检测体系的灵敏度。

1.7 LAMP 特异性试验

提取IBRV、蓝舌病病毒、赤羽病病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛白血病病毒、小反刍兽疫病毒和伪狂犬病病毒核酸，并以此为模板进行LAMP扩增，分析检测体系的特异性。

1.8 LAMP 反应时间

分别反应 5、10、15、20、25、30、40、50和60 min，评估反应时间。

2 结果与分析

2.1 内引物浓度梯度试验

分别用 0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、2.4 µmol/L 引物进行内引物浓度优化，发现最佳引物浓度为2.4µmol/L。其中，黄绿色为阳性结果，浅橙色为阴性结果（图1）。

图1 内引物优化结果

2.2 dNTP浓度梯度试验

分 别 用 0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2和 1.4 mmol/L dNTP浓度进行试验摸索，发现最佳dNTPs浓度为1.0 mmol/L。其中，黄绿色为阳性结果，浅橙色为阴性结果（图2）。

图2 dNTP优化结果

2.3 Mg2+ 浓度梯度试验

分别用 2、4、6、8、10、12 µmol/L 浓度进行试验摸索，发现Mg2+最佳浓度浓度为8 µmol/L。其中，黄绿色为阳性结果，浅橙色为阴性结果（图3）。

图3 Mg2+优化结果

2.4 温度梯度试验

分别采用 67、65、63 、60、57、55、50、45 ℃进行试验摸索，发现佳反应温度为65 ℃。其中，黄绿色为阳性结果，浅橙色为阴性结果（图4）。

图4 温度优化结果

2.5 LAMP特异性试验

特异性试验结果显示，蓝舌病病毒、赤羽病病毒、牛病毒性腹泻病毒等6种其他病原全为阴性，仅IBRV为阳性，说明所建立的LAMP技术特异性较好（图5）。

图5 特异性实验结果

2.6 LAMP灵敏度试验

分别采用不同核酸浓度106、105、104、103、102、101copies/µL进行试验摸索，最终确定IBRV灵敏度为103copies/µL。其中，黄绿色为阳性结果，浅橙色为阴性结果（图6）。

图6 灵敏度结果

3 讨论

IBR是由牛疱疹病毒I型引起的一种急性、热性、接触性传染病。此病在全球范围内广泛分布，主要损害牛的呼吸系统及生殖系统，给养牛业带来巨大经济损失[8]。目前，我国口岸动物检疫部门已明确规定凡是进境的牛及其制品必须检测IBRV。近年来，我国进境种（奶）用牛数量和种类不断增加，待检疫病种类较多，在实际检验检疫工作中，每进口一批活动物，往往要做上万次检测，因而需要花费大量时间和试剂，以及复杂的人工操作。因此，必须寻找一种高通量、高灵敏度、省时省力、经济且操作简单的检测方法，以加速口岸通关速度，提高口岸检测水平，并能有效防控外来动物疫病入侵。

可视化的逆转录环介导等温扩增（LAMP）方法相比其他方法，具有快速、高效、高敏感及高特异的特点[9]。冯蒙等[10]也建立了IBRV LAMP 方法。该法可在50 min内检出标准阳性质粒，且不发生交叉反应，通过肉眼直接观察即可判断结果。本研究以IBRV核酸作为研究对象，寻找该病毒的特异性保守基因序列，利用LAMP在线软件，设计筛选出特异性引物，利用具有链置换作用的Bst DNA聚合酶进行靶序列的识别和延伸，对待测靶序列进行超指数扩增，以验证引物的特异性和敏感性。在LAMP基本反应体系基础上，设置不同内引物浓度（0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、2.4 µmol/L），dNTP 浓 度（0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4、2.0、2.4 mmol/L），Mg2+浓度（2、4、6、8、10、12 mmol/L）和反应温度（45、50、55、57、60、63、65、67 ℃）分别进行试验，探索各因素对LAMP的影响，以获得最佳反应参数，最终建立了灵敏度高的IBRV LAMP检测方法，灵敏度可达到103拷贝/µL。本研究对牛白血病病毒等6种牛主要疫病病原进行特异性分析，结果仅IBRV为阳性，特异性良好。本研究在反应体系中添加了碱土金属离子指示剂羟基萘酚蓝（HNB）。由于反应副产物焦磷酸根离子和反应体系中的Mg2+生成焦磷酸镁沉淀，不断消耗游离Mg2+，导致反应前后颜色显著改变，从而使IBRV检测可视化。

4 结论

本研究建立的可视化IBRV LAMP检测方法具有特异性和敏感性高、操作简便、耗时短等特点，适用于口岸进出口动物的IBR快速检疫。

参考文献：

[1] GRIFFIN D，CHENGAPPA M M，KUSZAK J，et al.Bacterial pathogens of the bovine respiratory disease complex[J]. Veterinary clinics of north america food animal practice，2010，26（2）：381.

[2] BENO R M，JULIEN T，PHILIPPE K，et al.Bovine herpesvirusl infection and Infectious bovine rhinotracheitis[J]. Veterinary research，2007，38：181-209.

[3] 陈圣军，孔繁德，徐淑菲，等. 牛传染性鼻气管炎检测方法的研究进展[J]. 经济动物学报，2013，17（1）：37-40.

[4] 徐晓琴，冷雪，李真光，等. 牛传染性鼻气管炎诊断方法研究进展[J]. 动物医学进展，2010，31（1）：80-86.

[5] NOTOMT T H，OKAYAMA H，MASUBUCHI T，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic acids research，2000，28：e63.

[6] 张跃伟，李旭妮，郭盼盼，等. 荧光显色在环介导等温扩增（LAMP）检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的应用[J]. 农业生物技术学报，2010，18（3）：508-513.

[7] PAWAR S S，MESHRAM C D，SINGH N K，et al.Rapid detection of bovine herpesvirus 1 in bovine semen by loop-mediated isothermal amplification（LAMP）assay[J]. Archives of virology，2014，159（4）：641.

[8] JONES C，CHOWDHURY S. A review of the biology of bovine herpesvirus type 1（BHV-1），its role as a cofactor in the bovine respiratory disease complex and development of improved vaccines[J]. Animal health research reviews，2007，8（2）：187.

[9] ZHANG S Q，TAN B，LI P，et al. Comparison of conventional RT-PCR，reverse-transcription loopmediated isothermal amplification，and SYBR green I-based real-time RT-PCR in the rapid detection of bovine viral diarrhea virus nucleotide in contaminated commercial bovine sera batches[J]. Journal of virological methods，2014，207（10）：204-209.

[10] 冯蒙. 可视化检测牛传染性鼻气管炎病毒LAMP法的建立及其对流行状况的初步调查[D]. 南京：南京农业大学，2014.