高通量测序技术检测鸽群中病毒感染状况

王楷宬，庄青叶，邱 源，刘 朔，王素春，彭 程

（中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

鸽子是我国较受欢迎的食用动物之一，常与鸡、鸭、鹅一起在活禽交易市场销售，因而可以导致各种病原的相互传播。有些病原能在鸽子体内重组变异而产生新的病原。尤其是赛鸽，在训练和比赛中可与野鸟接触，具有将野鸟携带的病原传入家养赛鸽或者其他家禽的风险。已有研究者对鸽子感染病毒的种类进行过报道，包括副粘病毒1型、腺病毒、轮状病毒、疱疹病毒1型和圆环病毒等多种病原[1]。鸽子是禽类和人类病原的储存库，其携带的病毒可感染人类而发生新发传染病[2]。目前，我国对鸽子携带病原的种类和特性研究甚少。

动物病原的检测通常采用病原分离鉴定、PCR/RT-PCR、荧光定量PCR/RT-PCR、克隆测序分析等方法，往往针对已知的单种病原进行。而检测同一宿主或群体的多种病原时，需要使用不同的检测方法，甚至不同的实验室和实验人员，且不能检测未列入检测计划的动物疫病病原以及新型或未知病原。在对我国鸽子携带的病原种类尚不清楚的情况下，不适合采用传统方法，逐个进行病原筛查。随着高通量测序（NGS）技术和生物信息学的发展，这一难题得到解决。基于NGS的病原检测方法敏感性高，且可以不针对某些目标病原进行检测，而是对样品中携带的病原进行全景式扫描搜索。为了解我国鸽子的病毒携带情况，尤其是变异快、危害大的RNA病毒感染情况，采用高通量测序方法，对我国华东地区的肉鸽进行了病毒检测。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

Ion PGM Template OT2 200 Kit、Ion PGM Sequencing 200 Kit V2、E-Gel SizeSelect 2%Agarose、Ion 316 Chip Kit V2、Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Beads、Qubit核酸浓度测定仪及配套试剂：均购自Life technologies公司。其他仪器包括：超净工作台（美国Forma Scientific）；移液器（Eppendorf）；孵化器（德州诚信孵化设备有限公司）；高速台式离心机（德国Heraeus Biofuge primoR）；PCR扩增仪（Perkin Elmeter Gen Amp PCR System 9600）；QIAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen，德国）。高性能计算平台：Dell T630塔式服务器，具有2颗Intel（R）Xeon（R）CPU E5-2620 v3 @ 2.40GHz，内存264 G，存储23 T，操作系统版本CentOS Linux release 7.1.1503（Core）。

1.2 样品采集

在我国华东地区某省活禽交易市场，按照简单随机抽样方法，采集禽泄殖腔/咽喉双拭子60份，置于含有10%甘油和抗生素的PBS（pH 7.2）缓冲液中，-80 ℃保存。

1.3 核酸提取

将采集的60份样品充分混匀后，各取20 µL进行混合；将混合样品高速离心和0.22 μm滤膜过滤，去除大分子物质和细菌，再经DNase I 和 RNase A除去细胞外的游离核酸；使用QIAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen，德国）提取病毒核酸[3]，-80 ℃保存。

1.4 NGS文库构建

按照稍加修改的已报道方法[3]，将提取的病毒核酸构建为PGM测序仪可识别的文库：10 μL病毒 RNA，加入1 μL 100 μmol/L引物 A15N6（表1），72 ℃反应5 min，并置于冰上至少3 min；在上述反应混合物中加入4 µL 5× first-strand buffer、1 μL dNTP（100 μmol/L）、2 μL DTT（0.1 mol/L）、1 μL RNaseOUT ™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor（40 U/μL） 和 1 μL SuperScript®III Reverse Transcriptase（200 U/μL）（Invitrogen，USA），25 ℃ 反应 15 min，并 42 ℃反转录30 min，70 ℃ 15 min，终止反应；反应产物中再加入 1 μL RNase H（TaKaRa，Japan），37 ℃ 反应20 min。将反转录合成的单链cDNA经 Agencourt®AMPure®XP Reagent（Beckman Coulter，USA）纯化，加入引物B15N6（表1），70 ℃反应 5 min；再加入 1 μL Klenow fragment（5 U）（NEB，USA），5 μL 10× NEBuffer 2，2 μL dNTP（100 μmol/L）和 1 μL DTT（0.1 mol/L），37 ℃ 反应30 min。采用引物A30和B30进行文库扩增。反应体系包括：1× Phusion High-Fidelity Buffer，10 μmol/L 引物 A30 和 B30（表 1），0.5 U Phusion High-Fidelity DNA Polymerase（NEB，USA）。文库经 E-Gel® SizeSelectTMAgarose Gel回收，将350 bp 的DNA进行PGM测序。

表1 引物及其序列

1.5 NGS感染病原种类分析

将经E-Gel® SizeSelectTM Agarose Gel回收的文库均稀释为26 pmol/L；应用Ion PGM Template OT2 200 Kit，对DNA文库进行测序前的样品处理。将处理后的样品加样至Ion 316 芯片，置于PGM测序仪进行测序；采用standalone NCBI BLASTn tool[4]将测序得到的reads与 GenBank 核酸数据库进行比对（E值为10-5）。对BLASTn 分析结果，由MetaGenome Analyzer（MEGAN）[5]进行展示。将其中与病毒序列比对上的结果进行整理，识别鸽子感染的主要病原。

2 结果与分析

2.1 测序质量

芯片上样率为73%，测序得到质量较高的序列数据，Reads数量为4.58 M，平均测序长度为107 bp，≥Q20 碱基数为492.3 Mbp。测序数据已登录GenBank，登录号为SRR2157429。

2.2 病原分析

将测序数据与GenBank 核酸数据库进行比对发现，在我国华东地区的肉鸽群中检出5种病毒（图1），包括禽轮状病毒、鸽圆环病毒、鸽星状病毒、鸽冠状病毒和鸽微RNA病毒B。将归为同一类病毒的reads提取后，应用CLC genomics workbench 8.5.1（Qiagen，Germany）进行拼接，发现拼接后的序列经在线BLAST核对均正确。基因序列BLAST分类和reads数量见表2。

图1 MEGAN分析鸽子携带的病毒种类及其reads数量占病毒总reads数的比例

表2 基因序列BLAST分类和reads数量

3 讨论

我国对鸽子感染的病毒种类研究极少，至今仅报道过鸽群感染禽流感病毒[6-7]、新城疫病毒[8-9]、鸽圆环病毒[10-11]、鸭肝炎病毒[12]、网状内皮组织增生病毒[13]、鸽细环病毒[14]等。本次检测首次在我国鸽群中发现了禽轮状病毒、鸽星状病毒、鸽冠状病毒和鸽微RNA病毒B，为下一步开展鸽群中病毒感染情况监测提供了数据支持。这些病原在我国鸽群中的感染率和特性，今后将会被进一步研究和分析。

动物病原检测通常采用PCR等分子生物学方法或ELISA等血清学方法进行。由于PCR方法具有高敏感性和特异性，以及检测通量高、效率高等优点，已广泛被各病原监测实验室所接受。但是基于PCR的检测方法必须针对目标性病原开展，对检测的每种病原都要知晓基因序列信息，并分别建立特异性PCR检测方法。如，Roussan等[15]对鸡场的星状病毒、轮状病毒、呼肠孤病毒和腺病毒I型的感染情况进行检测，需要分别设计6个PCR，对所有样品进行检测，才能得到检测结果。这种检测方法只能涵盖列入监测计划的目标病原，而不能检测新发或新型病原[16]。对于研究数据较少的鸽群病毒感染状况，有目的地进行PCR检测并不能发现鸽群中主要感染病原。如本检测新发现的4种鸽群感染病原，往往由于之前未曾发现而被忽视。本检测采用NGS技术解决了这个问题，对鸽子样品中携带的RNA病毒进行全景式扫描搜索，并首次发现了我国鸽群中存在禽轮状病毒、鸽星状病毒、鸽冠状病毒和鸽微RNA病毒B的感染。

由于病毒性疫病，尤其是RNA病毒病[17-19]，对动物健康影响较大，且其病原变异速度快，更需要密切监测其分子进化趋势，因而本文选择病毒性病原进行检测。因检测出的病原种类与采集的样品种类有关，本检测采集泄殖腔/咽喉双拭子，能够检测主要的呼吸道和消化道病原，更换样品类型也可以检测其他病原。

4 结论

综上所述，本检测采用NGS方法，发现我国华东地区肉鸽主要携带禽轮状病毒、鸽圆环病毒、鸽星状病毒、鸽冠状病毒和鸽微RNA病毒B等5种病原，其中禽轮状病毒、鸽星状病毒、鸽冠状病毒和鸽微RNA病毒B等4种为国内首次报道。结果证实，NGS技术能够检测出动物群体的主要感染病原，是动物疫病检测的新思路。随着NGS费用的逐渐降低，该方法可用于规模化养殖场的疫病检测、净化等工作，可以减少实验室检测工作量，有利于全面地掌握动物病原感染状况，及时预警、处置和防控动物疫病的发生。

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