利用InDel指纹图谱评价鲁西南地区簇生朝天椒品种的相似度

姜 童，王 辉，陈 宁，付 翔，杨延杰，林 多

(青岛农业大学 园艺学院，青岛市园艺植物遗传改良与育种重点实验室，山东 青岛 266109)

簇生椒(Capsicumanmuumvar .fasciculatum)为茄科辣椒属辣椒的变种，因椒果均较小，又称为小辣椒，是一种世界性蔬菜或调味品[1]。簇生椒在中国的种植面积逐渐扩大，在辣椒产业中占据重要地位。目前，山东鲁西南地区簇生朝天椒栽培面积日益扩大，农业产业结构中占有重要地位，辣椒栽培品种混乱、定名混乱、杂交种同物异名、异物同名现象也逐渐显现，严重干扰了辣椒种业的健康发展。加强种质资源主要农艺性状评价及保护新育品种知识产权是改良和推广辣椒品种的关键，罗本钒[2]利用分子标记法与农艺性状评价法进行了小白菜遗传多样性分析及优良性状鉴定；秦倩等[3]利用SSR标记进行了油橄榄品种表型和品种多样性的聚类分析；朱姝等[4]进行8个水稻抗条纹叶枯病分子标记有效性的验证及评价。插入/缺失多态性(Insertion/deletion，InDel)标记是由于同一位点处的DNA序列在不同个体间发生了核苷酸片段的插入/缺失，根据目标位点两侧的序列设计特异引物进行PCR扩增，扩增片段的长度多态性即是InDel标记[5]，具有带型简单、密度高、变异稳定、多态性强、检测容易等特点。目前，InDel标记技术在番茄、水稻、玉米等作物的种质资源遗传多样性和亲缘关系方面的研究领域已有报道[6-8]，但对于利用InDel标记进行辣椒品种相似度评价的研究尚未见报道。

本研究利用InDel分子标记对供试的8份商品名不同的簇生朝天椒进行农艺性状构建指纹图谱来评价鲁西南地区簇生朝天椒的品种相似度，对一些地方特有辣椒品种的保护及种子市场的规范具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料来自济宁地区商品名不同的簇生朝天椒品种，共计8份，于2016年6月分别到各乡镇进行采样编号(表1)，样品-80 ℃保存，用于基因组DNA的提取。

表1 试验材料Tab.1 Experimental materials

1.2 农艺性状评价方法

2016年6月和9月，采用常规方法对鲁西南地区8个商品名不同的簇生朝天椒品种进行株高、果实个数、分枝数、单株簇数、平均每簇果数、叶色、鲜单果重等农艺性状指标进行调查；10月中旬烘干测定样品干质量，并计算干鲜比，果实色价采用GB10783方法测定。

1.3 InDel分子标记评价方法

1.3.1 InDel引物筛选 辣椒基因组DNA提取、质量检测、InDel-PCR扩增程序及聚丙烯酰胺凝胶电泳检测等参照姜童等[9]的方法进行。供试材料为8个植物学性状差异较大的干制辣椒品种(表2)。引物参照Li等[10]开发的辣椒InDel引物，从12条染色体上共251对InDel引物中筛选出60对InDel引物(图1)，引物由上海Sangon公司合成。

表2 用于InDel引物筛选的供试材料Tab.2 The tested materials for the screening of InDel primers

图1 60对引物在辣椒染色体物理图谱上的位置Fig.1 Location of 60 pairs primers on the physical map in pepper chromosome

1.3.2 指纹图谱构建 选用筛选的25对InDel引物对8个不同商品名的辣椒品种进行扩增，统计扩增条带数进行指纹图谱构建。

1.4 数据处理与分析

InDel标记的数据记录用Microsoft Excel进行数据整理。根据电泳结果，扩增材料在同一引物中，位点较高的记1，位点较低重复出现的记0，条带缺失记-。用SPSS 14.0软件完成试验统计和UPGMA聚类分析。

2 结果与分析

2.1 簇生朝天椒农艺性状评价

簇生朝天椒植株农艺性状比较结果显示(表3)，8个品种株高均在79.1～96.4 cm，抗倒伏性较好；分枝数集中在4～5簇；单株簇数最多的品种为SYJ-5，株型紧凑，单株簇数较少的品种为SYJ-6。从平均每簇果数调查来看，8个品种的平均单簇果个数为5个左右；叶色较突出的品种为SYJ-2、SYJ-3、SYJ-6、SYJ-8，表现为深绿色，其他品种均为正常绿色。

簇生朝天椒品种果实性状比较结果显示(表4)，8个品种果长为5.75～6.12 cm，SYJ-2和SYJ-5的果长存在显著差异，各品种辣椒果宽为1.36～1.43 cm，8个品种的果宽差异不显著。SYJ-2、SYJ-6的折合干椒产量分别为5 248.50，5 165.10 kg/hm2，且均显著高于其他品种(4 412.85～5 038.20 kg/hm2)。

表3 八个朝天椒品种植株农艺性状比较Tab.3 The comparison of agronomic traits among eight clustered pepper varieties

表4 八个朝天椒品种果实性状比较Tab.4 The comparison of fruit traits among eight clustered pepper varieties

2.2 InDel分子标记评价

2.2.1 InDel 引物筛选 试验中通过60对InDel引物在生物学性状差异较大、亲缘关系较远的8份材料进行PCR扩增，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果表明，其中25 对引物具有多态性(表5)，部分引物的筛选结果如图2所示，引物CIDH908、CIDH426有多态性扩增，所有材料均能扩增出清晰的条带且多态性好，稳定性高；本试验所用引物为以上步骤筛选出的25对具有多态性的InDel引物生物学性状差异较小、遗传背景较窄的8个不同商品名的簇生朝天椒进行指纹图谱构建。

2.2.2 指纹图谱构建 本试验用25对具有多态性的引物在8个不同商品名的簇生朝天椒材料检测的部分引物扩增图谱如图3，4所示。这25 对InDel引物在8份簇生辣椒材料中共扩增出 160个位点，扩增片段大小在 130～350 bp。只有引物CIDH267在本研究中8份簇生辣椒材料产生不同的位点，扩增片段大小在180～200 bp(图3)，其中，24对InDel引物扩增检测中无位点差异，部分引物扩增图谱见图4。采用25对InDel引物对8个辣椒品种构建指纹图谱(表6)，通过指纹图谱看出，只有SYJ-2和SYJ-6在引物CIDH267中与其他6个辣椒品种存在1个位点差异。参照中华人民共和国农业行业标准-玉米、水稻品种鉴定-DNA指纹方法判定标准(NY/T1433-2007)，结果表明，这8个不同商品名的簇生朝天椒为疑似同种。

表5 InDel标记信息Tab.5 The information of InDel marker primers

1～8.生物学性状差异较大、亲缘关系较远的8份材料。1-8.The variety of biological properties of the larger differences and distant relationship between the eight materials.

M.Marker；1～8依次是朝天椒品种SYJ-1～SYJ-8。图4同。M.Marker；1-8 is the variety of the clustered pepperSYJ-1-SYJ-8. The same as Fig.4.

Ⅰ.CIDH28；Ⅱ.CIDH776；Ⅲ.CIDH602；Ⅳ.CIDH360。

2.2.3 八个簇生朝天椒品种相似度评价 选取株高、分枝数、单株簇数、平均每簇果数、果长、果肩径、单鲜果重、单干果重、色价等级作为评价指标做数据均一化处理，利用SPSS 14.0软件处理系统进行表型性状UPGMA聚类分析(图5)，在遗传相似系数为0.78时聚为一个大类，包含8个品种；当遗传相似系数为0.58时聚为3类，第一类包含4个品种(SYJ-1、 SYJ-3 、SYJ-4、 SYJ-7 )，第二类包含3个品种(SYJ-2、SYJ-6、SYJ-8)，第三类只有品种SYJ-5；当遗传相似系数为0.4时聚为5类，第一类包含3个品种(SYJ-1、 SYJ-3 、SYJ-4)，第二类为品种SYJ-7，第三类为品种SYJ-2和SYJ-6，第四类为品种SYJ-8，第五类只有品种SYJ-5；当遗传相似系数为0.17时聚为6类，第一类为品种SYJ-1，第二类包含品种SYJ-3和SYJ-4，第三类为品种SYJ-7，第四类包含品种SYJ-2和SYJ-6，第五类为品种SYJ-8，第六类只有品种SYJ-5。表明该8个不同商品名辣椒品种形态相似程度大，亲缘关系相对较近，品种相似度较高。

表6 簇生朝天椒品种InDel指纹图谱Tab.6 The digital fingerprints of InDel markers on clustered pepper

图5 簇生朝天椒农艺性状UPGMA聚类分析Fig.5 UPGMA method cluster analysis for eight clustered pepper varieties based on agronomic traits

3 讨论与结论

随着辣椒栽培面积的不断扩大，品种的种类也不断更新，遗传基础变得越来越狭窄，以形态形状区分难度大，新品种的新颖性和特异性鉴定缺少凭据，种子领域现状也存在同物异名问题，给种子市场管理提出了挑战。张宝玺等[11]在“十一五”期间提出，辣椒品种的同质化严重，尽管培育的品种很多，而且市场上的辣椒品种性状相近、同物异名的现象屡见不鲜。目前，同质化或相似度评价方法主要有品种特性鉴定和分子标记鉴定，品种特性鉴定是法定的品种鉴定方法，具有准确性、科学性、能更直观地揭示品种间的来源差异等优点，但也存在工作量大、成本高、时间长、结果滞后等问题。而DNA指纹图谱技术则具有高效、准确、不受环境条件影响、实验操作简单、能够量化地体现出品种间的差异等优点。因此，将这2种方法结合起来进行分析，可以相互验证、相互补充，更能充分地揭示出地方品种(品系)的相似度及亲缘关系。

利用品种特性与分子标记进行植物不同物种间亲缘关系分析研究已被广泛应用。包文泉等[12]基于SSR标记的仁用杏主栽品种鉴别和指纹图谱构建；王庆彪等[13]对中国50个甘蓝代表品种进行EST-SSR指纹图谱的构建；张婉等[14]对白菜品种进行SSR指纹图谱数据库的构建。通过构建InDel 指纹图谱从分子层面上更精确、清晰地对品种相似性进行比较和研究。周延清等[15]对河南栽培大豆的RAPD品种鉴定和聚类分析；宋小丽[16]进行了亲缘关系密切的12个辣椒品种的 AFLP鉴定；王明明等[17]进行了木瓜属品种亲缘关系的SRAP分析。随着近年来测序技术的不断进步，分子标记InDel技术自产生以来，因有带型简单、密度高、变异稳定、多态性强、检测容易等优点在植物指纹构建及种质资源遗传多样性的鉴定和分类研究得到广泛的应用。Wang等[18]基于InDel和SSR序列遗传连锁图谱进行芜菁拟染色体汇编；梁爽[19]利用InDel和SSR整合大白菜分子遗传图谱；胡俏强等[20]进行了糯玉米杂交种纯度InDel分子标记鉴定与田间鉴定的相关性分析，结果显示，InDel标记鉴定结果与田间鉴定结果呈极显著正相关，可用于糯玉米杂交种纯度鉴定。而分子标记InDel在辣椒亲缘关系分析和品种相似度分析方面用的不是很广泛，利用品种特性与构建InDel指纹图谱结合对品种相似性进行比较和研究未见相关的报道。

本研究对8个不同商品名的簇生朝天椒品种进行基本农艺性状调查，基于表型数据(簇生朝天椒农艺现状UPGMA聚类分析) 与InDel分子标记(簇生朝天椒进行指纹图谱构建)相结合进行了生物学性状差异较小、遗传背景较窄的不同商品名的8个簇生朝天椒的亲缘关系及品种相似度分析，表明该8个不同商品名辣椒品种相似程度较大，同质化严重且存在同物异名现象。本研究结合 InDel分子标记构建指纹图谱数据与农艺性状数据的遗传相似系数矩阵存在极显著正相关，这与Lefebvre等[21]结果相似。由此认为，本研究扩增的InDel DNA片段散布于整个辣椒基因组中，并与本试验的表型性状QTR有很高的关联性。因此，结合簇生朝天椒农艺性状与综合利用InDel分子标记分析，能更准确鉴定、评价鲁西南地区簇生朝天椒品种的相似度，对地方辣椒品种的品质及品种保护具有一定的利用价值，有效地缓解了辣椒栽培品种混乱、定名混乱、种子同质化的现象，有利于种子市场的规范和种业的健康发展。

参考文献：

[1] 蒋向辉，佘朝文，许 栋，等. 2个朝天椒变种农艺性状调查及指纹图谱构建研究[J]. 中国农学通报，2010，26(8)：104-107.

[2] 罗本钒.小白菜遗传多样性分析及优良性状鉴定与利用[M].武汉：华中农业大学，2015.

[3] 秦 倩，王楠楠，李金花，等. 油橄榄品种表型和SSR标记的多样性及聚类分析[J]. 林业科学研究，2016，29(5)：676-681.

[4] 朱 姝，张亚东，朱 镇，等. 8个水稻抗条纹叶枯病分子标记有效性的验证及评价[J]. 华北农学报，2012，27(6)：146-151.

[5] 仪泽会，卢有飞，郭晓芹，等. 大白菜简单序列重复(SSR)和插入/缺失(InDel)标记的开发及通用性分析[J]. 农业生物技术学报，2012，20(12)：1398-1406.

[6] 申 璐，沈火林，柴 敏，等. 采用InDel和SSR标记分析番茄品种基因组DNA多态性[J]. 中国农业大学学报，2011，16(2)：34-42.

[7] 姚国新，黄文超. 利用水稻籼粳分化InDel标记鉴定育种材料的籼粳属性[J]. 杂交水稻，2013，28(3)：53-57.

[8] 葛 敏，蒋 璐，张晓琳，等. 利用Insertion/Deletion(InDel)分子标记检测玉米互交种混杂的原理及应用[J]. 分子植物育种，2013，11(1)：37-47.

[9] 姜 童，王 辉，林 多，等. 干制辣椒雄性不育系与保持系间多态性InDel标记的筛选[J]. 北方园艺，2017(15)：24-28.

[10] Li W P，Cheng J W，Wu Z M，et al. An InDel-based linkage map of hot pepper (Capsicumannuum)[J]. Molecular Breeding，2015，35(1)：32-34.

[11] 张宝玺，王立浩，毛胜利，等. “十一五”我国辣椒遗传育种研究进展[J]. 中国蔬菜，2010，1(24)：1-9.

[12] 包文泉，乌云塔娜，赵 罕，等. 基于SSR标记的仁用杏主栽品种鉴别和指纹图谱构建[J]. 西北农林科技大学学报：自然科学版，2017，5(6)：2-6.

[13] 王庆彪，张扬勇，庄 木，等. 中国50个甘蓝代表品种EST-SSR指纹图谱的构建[J]. 中国农业科学，2014，47(1)：111-121.

[14] 张 婉，崔继哲，于拴仓，等. 白菜品种的SSR指纹图谱数据库的构建[J]. 分子植物育种，2013，6(6)：843-857.

[15] 周延清，田苗苗，鲍 丹，等. 河南栽培大豆的RAPD品种鉴定和聚类分析[J]. 华北农学报，2006，21(2)：37-41.

[16] 宋小丽. 亲缘关系密切的12个辣椒品种的 AFLP鉴定[D].杭州：浙江大学，2008.

[17] 王明明，陈化榜，王建华，等. 木瓜属品种亲缘关系的SRAP分析[J]. 中国农业科学，2010，43(3)：542-551.

[18] Wang Y，Sun S L，Liu B，et al. A sequence-based genetic linkage map as a reference forBrassicarapapseudochromosome assembly[J]. BMC Genomics，2011，12：239.

[19] 梁 爽.利用InDel和SSR整合大白菜分子遗传图谱[D].郑州：郑州大学，2013.

[20] 胡俏强，陆海燕，吴月琴，等. 糯玉米杂交种纯度InDel分子标记鉴定与田间鉴定的相关性分析[J]. 江苏农业学报，2016，5(32)：999-1004.

[21] Lefebvre V，Goffinet B，Chauvet J C，et al. Evaluation of genetic betwun pepper inbred lines for cultivar protection purposes：comparison of AFLP，RAPD and phenotypic data[J].Theoretical and Applied，2001，102：741-750.