西藏山南地区内镜活检HER2阳性胃癌临床病理特征分析

次仁卓嘎,扎西卓玛,焦南林,2,张 伟,2*

(1西藏自治区山南市人民医院病理科,山南 856100;2安徽省皖南医学院弋矶山医院病理科;*通讯作者,E-mail:weisky1981@163.com)

胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和病死率分别居全球恶性肿瘤的第四位和第二位[1]。胃癌也是我国最常见的恶性肿瘤之一,在我国西藏地区也不例外,成为严重威胁高原居民健康的恶性肿瘤之一,且多数患者在确诊时已是晚期。寻找新的治疗途径如分子靶向治疗就成为晚期胃癌个体化治疗的当务之急。2010年ToGA试验[2]证实以人类表皮生长因子受体2(HER2)为靶点的分子靶向治疗是目前最为成功的案例,也是目前唯一一个具有肯定临床应用价值且被批准应用于晚期胃癌的分子靶标,可以使晚期胃癌患者总生存期超过1年。HER2阳性胃癌患者的筛选成为HER2靶向药曲妥珠单抗(赫赛汀)治疗的关键。目前,西藏山南地区胃癌患者的HER2阳性率尚未见报道,本课题将首次对本地区内镜活检胃癌患者进行HER2免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)和荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)检测,并观察其与年龄、性别、民族、Lauren分型、组织学分化程度及Hp感染等临床病理特征的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

收集西藏山南市人民医院2015-05～2017-08诊断的内镜活检胃癌标本84例,男性49例,女性35例,男女之比为1.4 ∶1;年龄26-79岁,平均57.0岁;藏族82例,汉族2例;胃食管连接部癌10例,胃底/体癌35例,胃窦癌39例;Lauren分型:肠型28例,弥漫型/混合型56例;组织学高/中分化32例,低分化52例。所有患者内镜活检之前均未行放化疗及生物治疗。

1.2 方法及结果判定

1.2.1 HER2免疫组化检测 内镜活检标本经10%中性福尔马林固定8-48 h,常规脱水,石蜡包埋,EnVision两步法检测HER2蛋白表达,HER2(克隆号:UMAB36)购自北京中杉金桥生物技术有限公司,严格按照试剂盒说明书进行,以PBS代替一抗作为阴性对照,用已知胃癌阳性病例作阳性对照。结果判定:免疫组化结果均由2名高年资病理医师进行双盲独立阅片。HER2判读标准依据《2016年中国胃癌HER2检测指南》[3],活检标本染色:0,任何肿瘤细胞无膜染色;+,肿瘤细胞团微弱或隐约可见膜染色(不管着色的肿瘤细胞占整个组织的百分比);++,肿瘤细胞团有弱到中度的基底侧膜、侧膜或完全性膜染色(不管着色的肿瘤细胞占整个组织的百分比,但至少有5个成簇的肿瘤细胞着色);+++,肿瘤细胞的基底侧膜、侧膜或完全性膜强染色(不管着色的肿瘤细胞占整个组织的百分比,但至少有5个成簇的肿瘤细胞着色)。HER2 IHC结果0和+表示阴性,+++表示阳性,++则进行荧光原位杂交(fluorescencein situ hybridization,FISH)检测。

1.2.2 HER2 FISH检测 对IHC(++)蜡块进行双探针HER2荧光原位杂交染色,预杂交液代替杂交液为阴性对照。步骤如下:将组织蜡块切成3-4 μm厚白片,切好的白片放入60 ℃烤箱烘烤2 h后常规脱蜡;使用3%H2O2-甲醇溶液室温湿盒内孵育15 min,消除内源性过氧化物酶活性,阻断背景中非特异性染色;再用蒸馏水(pH7.0)冲洗3次×3 min/次;之后滴加蛋白酶K室温湿盒内孵育15 min左右(同时运用荧光显微镜观察细胞消化程度),使蛋白成分消化而充分暴露细胞核及DNA片断;再使用原位杂交专用PBS(pH7.4)冲洗3次×5 min/次,蒸馏水冲洗2次×3 min/次;再滴加预杂交液,将湿盒置入38 ℃恒温水浴箱内孵育3 h,阻断背景非特异性染色;去除多余液体,滴加杂交液,原位杂交专用盖玻片封盖组织,再将湿盒放入38 ℃恒温水浴箱内孵育过夜;揭去盖玻片,37 ℃ 2×SSC缓冲液冲洗2次×5 min/次后,37 ℃ 0.5×SSC缓冲液冲洗1次×15 min/次,最后用37 ℃ 0.2×SSC缓冲液冲洗2次×5 min/次;滴加封闭液,操作完成。HER2 FISH检测试剂盒购自广州安必平医药科技股份有限公司。判读标准[2]:在扩增程度最高的区域中,对至少>30个连续肿瘤细胞核进行双色信号(红色代表HER2基因荧光信号,绿色代表17号染色体着丝粒CEP17)的计数和比值计算:①HER2基因荧光信号与17号染色体着丝粒荧光信号平均比值即HER2/CEP17>2.2,判断为阳性;②HER2/CEP17<1.8,判断为阴性;③HER2/CEP17位于1.8-2.2之间,再计数30个细胞,比值>2.0为阳性,<1.8为阴性。

1.2.3 Hp检测 Hp检测试剂盒购置福建泰普生物科学有限公司,严格按照试剂盒说明书进行操作。判读标准:在胃黏膜小凹内可找见蓝色弯曲的Hp杆菌即为阳性。

1.3 统计学处理

采用SPSS18.0软件进行数据处理,组间比较采用χ2检验,相关分析结果采用四格表列联系数r表示,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 内镜活检胃癌组织中HER2蛋白及基因的表达情况

84例胃癌活检标本中54例呈现出不同程度的HER2蛋白染色(见图1),其中IHC(+++)10例、IHC(++)28例、IHC(+)16例、IHC(-)30例。HER2蛋白阳性表达率为11.9%(10/84)。对IHC(++)的28例活检标本行FISH检测,其中2例HER2基因显示红色簇状信号,3例HER2基因显示红色点状信号且HER2/CEP17>2.2,因此,这5例均判为HER2基因扩增(阳性),余23例HER2基因均为红色点状信号且HER2/CEP17<1.8,因此,这23例均判为HER2基因无扩增(阴性)(见图2)。本组84例胃癌活检标本中HER2总阳性率17.9%(15/84)。

2.2 HER2阳性与胃癌患者临床病理特征的关系

Lauren分型肠型胃癌HER2阳性率高于混合型/弥漫型(χ2=5.843,P<0.05)。高/中分化胃癌HER2阳性率明显高于低分化胃癌(χ2=6.321,P<0.05)。此外,不同年龄、性别、民族、肿瘤部位的胃癌HER2阳性率均无统计学差异(P>0.05)。Hp感染组和无感染组的HER2阳性率差异并无统计学意义(P>0.05,见表1)。

图1 胃癌HER2蛋白IHC染色结果(EnVision两步法,×400)Figure 1 The results of HER2 protein with IHC staining in gastric cancer (EnVision two-step method,×400)

A.FISH检测HER2基因扩增(阳性) B.FISH检测HER2基因无扩增(阴性)图2 IHC(++)胃癌病例HER2基因FISH检测结果Figure 2 The results of HER2 gene with FISH in IHC(++)cases

2.3 Hp感染与胃癌患者HER2阳性表达的相关性分析

Hp感染与HER2阳性表达之间并无相关性(r=-0.118,P=0.285)。

3 讨论

胃癌是西藏地区发病率位居前列的恶性肿瘤之一,严重威胁着高原居民的生活和健康。分子生物学研究显示胃癌的发生发展是一个多因素、多阶段的过程,胃癌治疗基因水平的研究成为近年热点。ToGA研究对胃癌靶向治疗具有里程碑式的意义,它第一次通过全球多中心的Ⅲ期临床试验数据证实HER2基因对于晚期胃癌的重大意义。HER2基因是人类表皮生长因子受体(EGFR)家族一员,定位于人类染色体17q21上,其可通过MAPK和PI3K等多种途径导致肿瘤发生与转移[4]。目前关于HER2在胃癌中过表达率的报道存在较大差异,HER2阳性率为4%-43%[5,6]。分析原因可能是由于胃癌异质性较高(胃癌患者中约5%-30%存在肿瘤异质性),与HER2检测方法(IHC或IHC联合FISH)及受检标本类型(组织芯片、内镜活检标本或手术标本)的不同有一定的关系。多数学者采用IHC检测,将++和+++者均归入HER2阳性,大大提高了所报道的HER2阳性率。本研究是严格按照《2016年中国胃癌HER2检测指南》采用免疫组化结合荧光原位杂交法,HER2 IHC(+++)阳性率为11.9%(10/84),HER2 IHC(++)的28例行FISH检测后显示5例HER2基因扩增(阳性),本组84例胃癌活检标本中HER2总阳性率17.9%(15/84)。TOGA实验显示HER2 IHC(+++)占10.1%,HER2总体阳性率为22.1%;HER2阳性率在亚洲和欧洲人群中类似(23.5% ∶23.6%)。本研究HER2阳性率与TOGA实验基本一致。需要指出,TOGA实验所使用的标本类型为手术标本,本研究中标本类型为内镜活检标本。由于肿瘤异质性的原因,内镜活检标本可能并不能完全体现出肿瘤HER2高表达的区域,因此活检标本对于胃癌HER2检测的价值一直存在争议[7,8]。有研究[9]表明,胃癌活检标本的HER2阳性率略高于手术标本(23.2%vs19.7%),差异并无统计学意义。由于临床实际情况的限制,多数患者仅能获取内镜下活检标本,使用内镜活检标本进行HER2检测是不可放弃的一种手段;也有多数研究者认为尽可能多点内镜活检标本与手术标本的HER2检测具有很好的一致性[10-12]。

表1HER2与胃癌的临床病理特征的相关性分析(例)

Table1CorrelationbetweenHER2andclinicopathologicalcharacteristicsofgastriccancer(cases)

临床病理特征nHER2阳性阴性 χ2P年龄00610805 ≤60岁489(188)39(812) >60岁366(167)30(833)性别05220470 男性4910(204) 39(796) 女性355(143)30(857)民族00001000 汉族20(0) 2(100) 藏族8215(183) 67(817)部位03950530 胃食管连接部103(300) 7(700) 胃部7412(162) 62(838)Lauren分型58430016 肠型289(321)19(679) 弥漫型/混合型566(107)50(893)分化程度63210012 高/中分化3210(313)22(687) 低分化525(96)47(914)Hp感染05860444 阳性609(150)51(850) 阴性246(250)18(750)

本研究显示Lauren分型肠型胃癌HER2阳性率高于混合型/弥漫型,高/中分化胃癌HER2阳性率明显高于低分化胃癌(均P<0.05)。卞学艺等[13]报道177例胃癌中肠型胃癌阳性率显著高于弥漫型/混合型胃癌(28.1%vs12.5%,P=0.010 9),分化较好的胃癌阳性率显著高于分化较差的胃癌(37.0%vs10.7%,P<0.000 1)。包括TOGA实验在内的国内外多项研究结果均显示肠型胃癌HER2蛋白过表达及基因扩增率均高于混合型和弥漫型[14-16]。本研究首次对藏族胃癌患者活检标本进行HER2检测,结果显示藏族胃癌患者的HER2阳性率与汉族患者无明显差异,HER2阳性可能与民族无关(P>0.05)。国内有多项研究[17-19]发现HER2蛋白的表达与民族(汉族与维族,回族,哈萨克族等)没有相关性;但由于不同民族之间大样本的胃癌HER2研究报道不多,本研究中样本量少,所以尚不能确定HER2阳性与民族的相关性。

Hp感染在胃癌的发生发展中起到重要作用,是胃癌和胃癌前病变的主要致病因素[20]。多数学者认为,Hp感染是胃癌的启动因子,在全球范围内Hp的感染率>50.0%[21],我国Hp的感染率高于世界平均水平(40.0%-90.0%)[22]。目前关于Hp感染与胃癌HER2阳性的相关性报道较少。王治兰等[23]报道胃癌中Hp阳性率高达72.6%(122/168),但是HER2蛋白阳性与Hp感染并无相关性,提示Hp感染导致胃癌发生的机制并非是因为HER2基因的活化。本研究显示胃癌中Hp感染阳性率达71.4%(60/84),HER2阳性与Hp感染也无相关性(P>0.05)。由于本组样本量少,尚不能确定HER2阳性与Hp感染之间的关系。

2010年ToGA实验[2]已经证明了HER2靶向药曲妥珠单抗联合顺铂+氟尿嘧啶类能够使HER2阳性的胃癌患者死亡风险降低26%;与单纯化疗相比,联合化疗组的中位总生存期显著改善(从11.1月延长至13.8个月);从而确立了曲妥珠单抗在胃癌HER2阳性患者治疗中的地位。同年欧盟和美国FDA先后正式批准曲妥珠单抗联合化疗作为HER2阳性进展期胃癌的一线治疗方案。目前,关于HER2阳性与胃癌预后关系尚未定论。部分研究显示HER2阳性与胃癌预后有关。Ming等[24]研究182例胃癌患者时发现伴有HER2基因扩增的胃癌患者平均生存期922 d,无HER2基因扩增者平均生存期为3 243 d,前者5年存活率明显低于后者。Marx等[25]研究发现胃癌伴有淋巴结转移的HER2蛋白阳性率高于无淋巴结转移者,浸润深度达浆膜及浆膜外者的HER2阳性率高于浸润深度在浆膜以内者。笔者认为HER2阳性可能是胃癌不良预后的影响因素,是否为独立预后因子尚需进一步的研究。

综上所述,对西藏山南地区内镜活检胃癌标本进行IHC联合FISH可以检测出适合赫赛汀治疗的HER2阳性患者;并且该地区胃癌HER2阳性与其Lauren分型及组织学分化程度密切相关。

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