不同组分釉质黏结剂对牙龈卟啉单胞菌和变形链球菌的影响

陆珮珺,李 晅

(1上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔正畸科,上海市口腔医学重点实验室,上海市口腔医学研究所,国家口腔疾病临床研究中心,上海 200011;2上海市口腔病防治院口腔正畸科,复旦大学附属口腔医院口腔生物医学工程实验室;*通讯作者,E-mail:queenlixuan@hotmail.com)

固定矫治是治疗错颌畸形的重要手段之一,临床采用固定矫治的患者占半数以上。正畸治疗中龋病及牙周炎性反应是固定矫治过程中常见的并发症[1-5],严重者需中断矫治。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)是牙周病公认的证据充分的致病菌之一,且与慢性牙周炎的关系最为紧密,变形链球菌(Streptococcus mutans,SM)则是龋病的主要致病因素[6-8]。固定矫治系统中,釉质黏结剂是一个重要组成部分[9]。随着口腔材料的发展,目前临床常用的釉质黏结剂主要有化学固化、光固化及含氟光固化三大类。本研究旨在检测不同组分釉质黏结剂对牙龈卟啉单胞菌和变形链球菌增殖的影响,评价并筛选有较强抑菌作用的釉质黏结剂,为临床釉质黏结剂的选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株及主要试剂

标准菌株选用变形链球菌菌株SM UA159和牙龈卟啉单胞菌Pg ATCC33277标准菌株,所用菌株均由上海交通大学附属第九人民医院口腔微生物实验室提供。矫治器选用金属网底双翼托槽(新亚,中国)。

黏结系统分成三组,分别为化学固化型:UniteTM黏结树脂(3M Unitek,加利福尼亚,美国);光固化型:Transbond XT光固化树脂(3M Unitek,加利福尼亚,美国);含氟光固化型:GC光固化正畸黏结用水门汀(GC Fuji ORTHO LC,株式会社,东京,日本)。

1.2 人工唾液配制

不含氟人工唾液的配制,每1 000 ml中含KCl 1.3 g,NaCl 0.1 g,MgCl2·6H2O 0.01 g,CaCl2·2H2O 0.03 g,细菌蛋白胨(Bactopeptone)0.5 g,KH2PO40.027 g,K2HPO40.035 g。调整pH至7.0,高温高压灭菌后备用。

1.3 细菌溶液配制

细菌溶液配置,将变形链球菌菌株SM UA159和牙龈卟啉单胞菌Pg ATCC33277标准菌株用脑心浸液培养基(Brian Heart Infusion;BHI,Biomerieus Sa公司,法国)在含95%N2和5%CO2的37 ℃厌氧培养箱中复苏及传代。实验所用菌液均为传代2次的新鲜菌液,使用前用紫外分光光度计测定并调整菌液光密度值,以保证菌液浓度的一致性。

1.4 离体牙制备及托槽黏结

取离体双尖牙,双氧水处理浸泡,去除牙周膜组织,高温高压灭菌后备用。

离体牙牙面使用37%的Ultra-Etch(Ultradent product Inc.,犹他州,美国)酸蚀处理,干燥后每组离体牙采用同一种组分釉质黏结剂进行黏结,将金属网底双翼托槽黏结至离体双尖牙牙冠中心,确保刮除溢出的釉质黏结剂,以模拟临床使用情况。

1.5 离体牙培养

根据釉质黏结剂不同(化学固化组,光固化组及含氟光固化组)分为三组,每组30个样本。将离体牙黏结固定矫治器后置入菌液,分别培养1 d、3 d和5 d取出,使用人工唾液漂洗去除没有黏附在离体牙表面的细菌,然后将每组离体牙放入3 ml生理盐水的离心管,在漩涡混合器上振荡60 s,将离体牙表面黏附的菌振荡下形成含菌悬液备用。

1.6 聚合酶链式反应(PCR)检测细菌增殖

使用One-tag PCR快速反应试剂(M0486L,NEB公司,美国)进行检测,吸取细菌悬液2 μl加入10 μl的one-tag PCR试剂中,再加入上下游引物各1 μl,加入6 μl无菌水,混匀后放入PCR仪进行目标细菌基因扩增,并于1%琼脂糖电泳分析表达。将含菌悬液分别进行PCR检测。分别参照GeneBank中16S rDNA基因序列NR-074234.1和23S rDNA基因序列NR-076188.1,合成检测Pg菌16SrDNA基因和SM菌23S rDNA基因的引物。Pg菌引物基因:上游(F):5′-AGGCAGCTTGCCATACTGCG-3′,下游(R):5′-ACTGTTAGCAACTACCGATGT-3′。SM菌引物基因:上游(F): 5′-ACGTGCGAGGTTAAGTTGAAG-3′,下游(R),5′-TTGTCTGTGCAACCCCACAT-3′。实验操作按试剂盒说明进行,取相对数值进行统计学分析。

1.7 统计学分析

采用SAS6.0统计软件进行分析,对三组在不同观测时间的Pg和SM增殖与培养1 d化学固化组相应细菌增殖对比,取倍率进行统计学分析。采用配对t检验比较三组组内不同时间点与该组1 d时细菌增殖差异;采用t检验比较三组组间相同时间点的细菌增殖。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组分釉质黏结剂组离体牙表面Pg的增殖结果

不同组分釉质黏结剂组Pg的PCR结果见表1。在各组内部,随着培养天数的增加,化学固化组Pg增殖显著增加,培养3 d增殖为培养1 d的106%,而培养5 d为培养1 d的116%,差异有统计学意义(3 d:P<0.05,5 d:P<0.01)。光固化组及含氟光固化组Pg增殖随培养天数的增加未见明显增加,差异无统计学意义。光固化及含氟光固化组培养3 d和5 d的Pg增殖与化学固化组相比差异有统计学意义(P<0.01),光固化组及含氟光固化组各时间段Pg菌含量无显著差异。

表1牙龈卟啉单胞菌的增殖结果

Table1TheproliferationofPgafterculturefordifferenttimeineachgroup

组别1d3d 5d 化学固化组1001±00551063±0023∗1158±0001∗∗光固化组0997±00850990±0001##1007±0002##含氟光固化组0961±00230986±0001##1005±0004##

同组与1 d比较,*P<0.05,**P<0.01;同时间与化学固化组相比,##P<0.01

2.2 不同组分釉质黏结剂组离体牙表面SM的增殖结果

不同组分釉质黏结剂组SM的PCR结果见表2。在各组内部,随着培养天数的增加,化学固化组及光固化组SM菌增殖逐步增加。培养5 d时,化学固化组和光固化组SM增殖分别为培养1 d时的107.2%和107.8%,差异有统计学意义(化学固化组:P<0.05,光固化组:P<0.01)。而含氟光固化组在培养3 d和5 d呈现不同程度的SM增殖下降情况;与培养1 d相比,培养3 d下降27%,培养5 d下降10%,差异均有统计学意义(P<0.01)。培养3 d和5 d,光固化组及化学固化组SM增殖差异无统计学意义,含氟光固化组较化学固化组及光固化组SM增殖显著降低(P<0.01)。

表2变形链球菌的增殖结果

Table2TheproliferationofSMafterculturefordifferenttimeineachgroup

组别1d3d 5d 化学固化组1000±00350986±0028 1072±0001∗光固化组0998±00131039±00011078±0001∗∗含氟光固化组1008±00170732±0000∗∗△△##0907±0000∗∗△△##

与1 d比较,*P<0.05,**P<0.01;同时间与化学固化组相比,△△P<0.01;同时间与光固化组相比,##P<0.01

3 讨论

固定正畸治疗中,矫治装置改变了患者的口腔内环境,口腔微生态环境发生很大的变化。托槽的安放,增加了口腔内与食物接触的表面积,表面凹凸不平的设计使细菌更容易在牙体表面附着并形成菌斑,增加龋病风险[2,4,8],菌斑主要分布在牙龈线、托槽和弓丝周围[10]。托槽黏结前对牙釉质的酸蚀造成的粗糙表面增加了釉质白斑的发生率[11]。弓丝及其他辅助矫治装置的安放让口腔清洁的难度剧增,进一步加重龋病风险。目前评价患者龋活性的常用指标之一就是测定唾液中的变形链球菌浓度,但其受唾液的其他参数,如流速、流量及pH值等的影响较大[12]。本实验采用PCR技术,以牙菌斑中变形链球菌的增殖表达作为测量指标,能更客观地反映出致龋危险性。

同时,固定正畸治疗也会引起牙周组织的反应,托槽的底部与牙龈边缘较近,有时甚至紧靠牙龈缘,容易积聚大量的细菌和软垢,形成牙结石,进而引发牙龈或者牙周炎性反应,例如牙龈组织的增生或萎缩、牙槽骨和牙根的吸收,龈沟液的变化等[3,13,14]。这些牙周组织的反应是否是一种长期的、不可逆的损伤,还存在争论,但是对于口腔卫生状况良好的患者,正畸治疗益大于弊,是学术界的认识趋势[15]。牙龈卟啉单胞菌是研究广泛且证据充足的重要牙周致病菌之一,是革兰氏阴性厌氧菌,对标本的输送时间、条件要求很高。本实验采用PCR技术,直接检测牙龈卟啉单胞菌的DNA拷贝数,有较高的精确度,赵焕英等[16]的研究也证实16S rDNA为基因引物的PCR技术的敏感性及特异性较高。

托槽的底板与牙体组织存在一定的间隙,使用釉质黏结剂一方面将托槽与牙面黏合,另一方面也充填了上述间隙,从而使托槽底板和牙体表面更贴合。本实验选用了临床上常用的釉质黏接剂,分别是化学固化、光固化及含氟光固化三种,检测在釉质黏结剂的影响下牙周炎及龋病特异性菌株的增殖反应。本研究发现,化学固化组Pg随着培养天数的增加增殖显著增加,离体牙在菌液中培养3 d与1 d的数量相比差异明显,培养5 d后更有显著增长,说明化学固化组的釉质黏结剂对Pg的增殖和对牙周炎性反应的发生没有抑制作用,这与王建宁等[17]的体内研究结果趋势一致。同时我们发现,光固化组及含氟光固化组Pg随培养天数的增加未见明显增殖,并较同时间点化学固化组有显著差异,这说明与化学固化釉质黏结剂相比,光固化及含氟光固化釉质黏结剂对Pg有一定的抑制能力,对牙周炎性反应有一定的抑制作用。Sigusch等[18]和Lee等[19]的体外研究发现光固化灯的照射可以促进釉质黏结剂的聚合作用,减少残余单体含量,从而使牙龈成纤维细胞的毒性作用减少。本研究结果也在一定程度证实了光固化灯对牙周炎性反应的抑制作用,同时发现氟离子的存在可以进一步减少釉质黏结剂对牙周组织的不利影响。

多项研究表明,含氟光固化黏结剂可以释放阳离子和氟离子,可以抑制菌斑中致龋菌的聚集,降低致龋风险[20-22]。本研究中,随着培养天数的增加,化学固化组及光固化组SM增殖逐步增加。而含氟光固化组在培养3 d和5 d呈现不同程度的SM增殖下降情况,并且较化学固化组及光固化组相比差异有统计学意义(P<0.01)。这与文献报道结果一致[20-22]。含氟光固化组中,培养5 d较3 d SM菌增殖略有上升,这也提示氟离子对SM的抑制作用具有一定时效性,从而进一步提示临床在正畸治疗中,按照特定间隔定期涂氟有助于保持氟离子浓度,从而有助于防龋。

综上所述,含氟光固化及光固化釉质黏结剂在短期内对Pg有一定抑制作用,含氟光固化釉质黏结剂对其的抑制作用更显著;含氟光固化釉质黏结剂对SM有显著抑制作用。因此,本研究提示,在固定正畸过程中使用含氟光固化釉质黏结剂有助于减少龋病和牙周炎症的发生。

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