响应面法优化超声辅助提取花椒叶黄酮工艺研究

崔鹏，高元栋，李玉文，袁岐山

（1.黄河水利职业技术学院环境与化学工程系，河南开封475004；2.开封市绿色涂层材料重点实验室，河南开封475004；3.河南大学化学与化工学院，河南开封475004；4.河南中烟工业有限责任公司技术中心，河南郑州450000）

花椒，落叶灌木或小乔木，生于林缘、灌丛或坡地石旁，是一种重要的中药材。花椒叶中含有芳香油、糖苷、蛋白质、纤维素、维生素、矿物质元素、黄酮类化合物等多种成分[1-2]。其中的活性成分黄酮类化合物具有抑菌、抗癌、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗衰老等药理功效，已经广泛应用于食品、药品、日用化工等领域[3-5]。目前常用的黄酮提取方法有：浸提法、大孔树脂吸附法、萃取法、超声辅助法[6-7]。其中浸提法较为成熟，但提取缓慢，溶剂消耗量大，提取效率略低：大孔树脂吸附法吸附速度快，选择性好，但操作复杂，工艺要求较高：溶剂萃取法，纯化度高，生产周期短，但提取率低，试剂成本高，有毒且易燃[8]：超声辅助法操作简单、方便快捷、精度高、溶剂消耗量少、成本低、无污染等优点[9-13]。因此本试验利用超声辅助法探讨花椒叶中黄酮的提取工艺，并用中心组合设计法（Central Composite Design，CCD）响应面对其进行优化，确定最佳工艺参数，为花椒叶的进一步开发应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品与试剂

花椒叶：山西省运城近郊；芦丁标准品（试剂纯度≥98%）：中国药品生物制品鉴定所本试验所；无水乙醇（分析纯）：安徽安特食品股份有限公司；亚硝酸铝（分析纯）：焦作市化工三厂；氢氧化钠（分析纯）、硝酸铝（分析纯）：天津市恒兴化学试剂制造有限公司；过氧化氢（分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；硫酸亚铁（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；水杨酸（分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；2，2-联氮基-双-（3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸）二铵盐[2，2-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic），ABTS]（分析纯）：合肥博美生物科技有限公司。

1.1.2 样品预处理

取新鲜的花椒叶，洗净后60℃干燥、粉碎并过筛，装入棕色瓶中备用。

1.1.3 仪器与设备

TU-1810紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；FA2004N电子天平：上海精密科学仪器有限公司；KQ-100E超声波：南京先欧仪器制造有限公司；GM-0.33A隔膜真空泵：天津津腾科技发展有限公司；FW-100高速万能粉碎机：北京中兴伟业仪器有限公司；101-1A电热鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取

准确称取处理后的花椒叶样品1.000 0 g，与不同体积分数的乙醇混合、搅拌并静置15 min，在不同的超声温度下，选择不同的超声时间制得待测样品提取液，用30%乙醇定容至50 mL容量瓶中，低温保存。进行3次平行试验，取算术平均值。

1.2.2 芦丁标准曲线及黄酮含量的测定

准确称取0.020 0 g芦丁标准品，用30%乙醇定容至100 mL，配置成浓度为0.20 mg/mL的标准溶液。用移液管准确移取 0.00、2.50、5.00、7.50、10.00、12.50 mL的标准溶液于25 mL容量瓶中，加入1.00 mL 5%亚硝酸钠溶液、1.00 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀静置5 min，然后分别加入10.00 mL 4%氢氧化钠溶液，用30%乙醇定容至刻度线，摇匀静置15 min。在波长为505 nm的条件下测吸光度。以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.3 单因素试验

取1.000 0 g花椒叶，选取不同的乙醇体积分数，相应的液料比，不同的提取时间和不同的超声温度制得待测样品，测定吸光度值，试验平行3次，取算数平均值。具体各因素水平见表1。

表1 单因素试验条件Table 1 Experimental conditions of single-factor

1.2.4 花椒叶黄酮抗氧化试验

以·OH和ABTS+·的清除率来考察花椒叶中黄酮的抗氧化性。

1.2.4.1 ·OH的清除

参照罗松明等[14-15]的方法，以水杨酸比色法测定羟基自由基清除率。取不同浓度的样品液1.00 mL，依次加入2.00 mL亚硫酸铁、1.50 mL水杨酸、0.10 mL过氧化氢，摇匀，置于暗处30 min，以蒸馏水作参比，于510 nm波长测定吸光度。清除率公式为：

式中：A0为生成的羟基自由基溶液吸光度值；A1为样品液和生成羟基自由基溶液吸光度值；A2为样品液吸光度值。

1.2.4.2 ABTS+·的清除

参照韩光亮等[16]方法，以分光光度法测定ABTS+·清除率。取不同体积分数样品液2.00 mL，与8.00 mLABTS溶液混合，混匀，置于暗处30 min，以蒸馏水作参比，于517 nm波长测定吸光度。ABTS+·清除率公式为：

式中：A0为样品液和ABTS溶液吸光度值；A1为ABTS溶液吸光度值；A2为不含ABTS溶液时样品液吸光度值。

1.2.5 CCD响应面试验设计与优化

依据单因素试验结果，参照周辉[17-18]等方法，运用Design Expert 8.0.6软件CCD响应面试验设计四因素五水平试验，并优化提取工艺，试验平行3次，取算数平均值。具体因素水平编码条件见表2。

表2 因素水平编码表Table 2 Factors and levels of CCD test

1.3 数据处理

参照王彦平等[19-20]方法，试验数据采用origin7.5软件制图，分析单因素试验结果：运用Design Expert 8.0.6软件进行响应面结果分析和图形输出。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

试验获得芦丁标准系列方程为：y=9.4186x+0.0032，R2=0.999 6，该标准曲线在0 mg/mL～0.01 mg/mL范围内呈线性关系。

芦丁标准曲线如图1所示。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 乙醇体积分数对花椒叶黄酮提取率的影响

称取1.000 0 g待测样，以不同体积分数的乙醇，一定液料比、超声时间、超声温度进行单因素试验，测定、计算黄酮提取率，结果见图2。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 The standard curve of rutin

图2 乙醇体积分数对花椒叶黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of percentage of ethanol volume on the extraction rate of flavonoids from leaves of Zanthoxylum

如图2所示，随着乙醇体积分数的增大黄酮提取率增大，在60%时黄酮提取率最大，之后呈现下降趋势。推测是由于体积分数过高，不利于溶解黄酮物质。此外，当体积分数过高时，会溶出醇溶性的杂质、色素和脂类物质影响黄酮的提取率。因此选择乙醇体积分数为60%。

2.2.2 液料比对花椒叶黄酮提取率的影响

称取1.000 0 g待测样，以不同液料比，一定体积分数的乙醇、超声时间、超声温度进行单因素试验，测定、计算黄酮提取率，结果见图3。

如图3所示，随着液料比的增大黄酮提取率也逐渐增大，在20∶1（mL/g）时提取率达到最大，之后呈下降趋势。液料比的增加有利于黄酮类物质溶出，但液料比过大时，会导致溶液浓度变小，从而影响黄酮类物质对超声的提取，以至于黄酮提取率下降。因此选择液料比为 20∶1（mL/g）。

2.2.3 超声时间花椒叶黄酮提取率的影响

称取1.000 0 g待测样，以不同超声时间，一定体积分数的乙醇、液料比、超声温度进行单因素试验，测定、计算黄酮提取率，结果见图4。

图3 液料比对花椒叶黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of flavonoids from leaves of Zanthoxylum

图4 超声时间对花椒叶黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of flavonoids from leaves of Zanthoxylum

图5 超声温度对花椒叶黄酮提取率的影响Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate of flavonoids from leaves of Zanthoxylum

表5 响应面试验设计与结果Table 5 Design and result of CCD

如图4所示，随着超声时间的增加黄酮提取率增加，在20 min时提取率达到最大，而后又下降。这可能是由于随着时间的增加，乙醇挥发加快，反应体系中温度升高，溶出黄酮有所分解，从而影响提取率。因此选择超声时间为20 min。

2.2.4 超声温度花椒叶黄酮提取率的影响

称取1.000 0 g待测样，以不同超声温度，一定体积分数的乙醇、液料比、超声时间进行单因素试验，测定、计算黄酮提取率，结果见图5。

如图5所示，随着超声温度的增加黄酮提取率增加，在60℃时提取率达到最大，而后呈现急剧下降趋势。这可能是因为温度越高，超声产生了大量热能，导致黄酮物质分解。因此选择超声温度为60℃。

2.3 响应面法优化工艺条件

2.3.1 响应面试验设计及结果

根据响应面设计原理和因素编码表（如表5所示），响应值为花椒叶中黄酮的提取率（Y），使用Design-Expert8.0.6软件的CCD模块进行试验设计和结果分析，具体如表5所示。

2.3.2 模型的建立及方差分析

参照王燕等[21-23]的方法，使用Design-Expert8.0.6软件将试验模型进行分析，得经回归拟合后，由响应面分析法得出关于超声辅助法提取黄酮得率的二次回归拟合方程

对所建模型进行一系列分析，具体结果如表6所示。

表6 多元回归模型方差分析Table 6 Analysis of variance for the response surface quadratic model

由表6可得，该模型总体水平上为显著。R2=0.9954，说明方程的线性关系显著。模型的变异系数CV=0.89%，说明模型的变异系数低。P＜0.000 1说明该模型具有极显著性。失拟项P=0.119 5，不显著，说明非试验因素对提取率影响较小。证明该试验值有较高的精密度及可靠性。综合发现该模型是可以用来分析和预测花椒叶中黄酮的提取量。根据F值的大小，推测本试验几个影响因素的重要性为：乙醇体积分数（A）＞超声时间（B）＞液料比（C）＞超声温度（D）。用模型预测出来的最佳条件是：乙醇体积分数为60.07%，超声时间为20.35 min，液料比为 20.12∶1（mL/g），超声温度 60.22 ℃，此时花椒叶中黄酮的提取量为10.18 mg/g。

2.3.3 响应面分析

用Design-Expert8.0.6软件绘制以黄酮提取率为响应值的各因子交互作用的响应面图。具体如图6～11所示。

图6 超声时间与超声温度的响应面和等高线Fig.6 The response surface and contour figure about ultrasound time and ultrasonic temperature

图7 超声时间与液料比的响应曲面和等高线Fig.7 The response surface and contour figure about ultrasound time and liquid-solid ratio

图8 液料比与超声温度的响应曲面和等高线Fig.8 The response surface and contour figure about liquid-solid ratio and ultrasonic temperature

图9 乙醇体积分数与超声时间的响应曲面和等高线Fig.9 The response surface and contour figure about percentage of ethanol volume and ultrasound time

图10 乙醇体积分数与液料比的响应曲面和等高线Fig.10 The response surface and contour figure about percentage of ethanol volume and liquid-solid ratio

图11 乙醇体积分数与超声温度的响应曲面和等高线Fig.11 The response surface and contour figure about percentage of ethanol volume and ultrasonic temperature

由图6～9可以看出，提取率随着超声时间的增大而增大，在20 min时达到最大值，而后开始下降。超声温度和液料比呈现先上升后下降的趋势。随着液料比的增加，提取率呈增加趋势，超声温度也呈现先上升后下降的趋势。乙醇体积分数与超声时间趋势也大致相同。由等高线图可以看出，等高线呈椭圆形，说明超声时间与超声温度、超声时间与液料比、液料比与超声温度、乙醇体积分数与超声时间的交互影响较为显著。由图10可以看出，随着乙醇体积分数的增加，提取率也呈先上升后下降的趋势，液料比的变化趋势也与之相似。说明乙醇体积分数与液料比的影响较大，表现为曲线更为陡峭。由等高线图可以看出，等高线呈扁椭圆形趋势，说明其交互作用影响更为显著。由图11可以看出，随着乙醇体积分数的增加，提取率随超声温度的增加呈现先升高后下降的趋势，表明乙醇体积分数与超声温度对试验的影响更大，等高线呈更为扁平的椭圆形，表明乙醇体积分数和超声温度的交互作用最为显著，因此曲线最为陡峭。由此可见，乙醇体积分数与超声温度的交互作用最为显著。

2.4 最优工艺及验证试验

由于考虑到实际操作，将最优提取条件调整为乙醇体积分数 60%、超声时间 20min、液料比 20∶1（mL/g）、超声温度60℃，进行3次平行试验，得到花椒叶中黄酮提取率平均值为10.13 mg/g。与理论预测值接近，说明该模型可用于花椒叶黄酮提取工艺的优化。

2.5 抗氧化能力测定结果分析

2.5.1 对·OH的清除

考察花椒叶中黄酮类物质对·OH的清除能力，当提取液浓度为2.00 mg/mL时清除率达到最高57.21%，说明花椒叶黄酮类物质对·OH具有较好的清除作用。

2.5.2 ABTS+·的清除

考察花椒叶中黄酮类物质对ABTS+·的清除能力，当提取液浓度在4.00 mg/mL时自由基的清除率达到47.32%，也证明了花椒叶黄酮类物质具有较好的抗氧化性。

3 结论

使用超声波提取法提取花椒叶中的黄酮，经Design-Expert8.0.6优化，最优试验条件如下：乙醇体积分数 60%、超声时间 20 min、液料比 20∶1（mL/g）、超声温度60℃，在此条件下黄酮平均提取率为10.13 mg/g，与模型预测值10.18 mg/g较为接近，说明该模型可用于花椒叶黄酮提取工艺的优化。研究发现花椒叶中黄酮提取液对·OH的清除率57.21%，对ABTS+·的清除率47.32%，证明该提取物具有较好的抗氧化能力。另外，超声提取作为一种清洁、高效的提取手段被用于天然有效成分的提取中，不仅可以较为显著的降低成本，而且还可以提高其提取率，该方法对花椒叶中黄酮的提取具有一定的实际意义。

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