2014—2015年豫南地区猪流行性腹泻病毒S基因变异分析

董建国，王 瑞，曲哲会，赵 瑜，刘 涛

(信阳农林学院牧医工程学院，信阳 464000)

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的猪的一种高度接触性肠道传染病[1]，以排水样粪便、呕吐、脱水和食欲下降、精神沉郁为主要特征。对刚出生的仔猪危害最大。该病于1971年在英国首次暴发，随后瑞士、法国、中国、日本、朝鲜和美国等国家均发生该病，呈地方流行性[2-5]。PEDV是有囊膜的RNA病毒，属于冠状病毒科α冠状病毒属成员。PEDV基因组全长28 kb左右，包括7个开放阅读框，它们分别编码四个结构蛋白(S、E、M和N)及三个非结构蛋白(pp1a、pp1ab和ORF3)。PEDV S蛋白由1 383个氨基酸组成，是最大的结构蛋白。S蛋白是糖蛋白，位于病毒粒子表面[6]。有研究表明S蛋白能够激活宿主产生中和抗体。已经发现四个中和表位(COE：aa 499—638，SS2：aa 748—755，SS6：aa 764—771，2C10：aa 1 368—1 374)[7-9]。因此，S蛋白在PEDV遗传演化中具有重要作用。

2010年以前，PED在中国呈散发状态。但是，2010年以后，新的变异毒株在中国许多地区出现，导致刚出生小猪严重腹泻，给我国养猪业造成巨大的经济损失。PEDV变异毒株能够引起1～10日龄仔猪几乎100%的感染率和80%～100%的致死率[10-11]。河南是中国中部养猪最多的省份，但是近些年部分猪场发生PED，导致大规模的仔猪死亡。因此，本研究调查了最近河南地区不同PEDV分离株S基因的改变情况，以便进一步了解该地区PEDV的流行病学，为疾病的防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病料

河南省各地区疑似暴发PEDV的自然发病猪，采集发病猪肠道组织及内容物，无菌处理，于-80 ℃冻存备用。

1.2 细胞和菌体

所用宿主菌E.coliDH5α感受态细胞由信阳农林学院牧医工程学院传染病实验室保存并提供。

1.3 主要试剂

病毒DNA/RNA提取试剂盒购自Magen公司；反转录试剂盒购于Promega公司；RT-PCR相关试剂盒购自TOYOBO生物科技有限公司和Vazyme公司；DNA Marker DL2000等购自TaKaRa公司；胶回收试剂盒购自Promega公司；EB替代染料，；pEASY-Blunt Simple Cloning Vector和Trans-5α感受态细胞均购自北京全式金生物技术有限公司。

1.4 引物设计与合成

根据GenBank中发布的CV777和近些年发布的PEDV变异毒株序列保守区域设计4对特异性引物，将S基因分成4个片段(S1、S2、S3、S4)进行扩增，每两段之间有一部分重叠区域，引物由上海生工生物工程公司合成。引物信息见表1。

表1PEDVS基因扩增引物序列

Table1SequencesofamplifiedPEDVSgene

名称Name序列(5'→3')Sequence扩增大小/bpAmplificationsizeS1FTAGTGATGTTGTGTTAGGCTTGTTG1054S1RAGGATCTGAGGAATTACTGCAAACS2FCATACTGCTTTAGGAACAAATCTT1039S2RACAACTGTCCAGAATCAGATGTATAS3FTTATTACCCTTACAAATTCTAGC1083S3RGACTAATAGCCTCTTTAACACTCTS4FGCTGAGTCTTTTAACTCTGCTAT1200S4RAGACTTCGAGACATCTTTGACA

1.5 核酸提取及目的基因反转录扩增

将处理的病料根据Magen公司产品试剂盒进行病毒核酸的提取，然后根据TaKaRa反转录试剂盒，以四个片段的下游引物进行病毒RNA的反转录扩增合成cDNA。运用TaKaRa高保真酶扩增S基因，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定条带大小。

1.6 基因克隆和序列分析

PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，使用Promega公司胶回收试剂盒对目的片段进行胶回收，然后连接到北京全式金生物有限公司的pEASY-Blunt Simple Cloning Vector上，经过转化挑菌鉴定后送往测序公司进行测序。将测序正确的序列运用Lasergene的SeqMan软件进行序列拼接，随后用于Lasergene的Meglian软件和Mega5.0对全长S基因进行序列比对分析和构建系统进化树。

将所获得的PEDVS基因核苷酸序列均上传至GenBank。

2 结 果

2.1 S基因核苷酸序列

38株PEDV临床样品信息和S基因扩增片段大小见表2，S基因在GenBank中的编号为KY211038到KY211075。

表2临床样品信息和扩增片段大小

Table2Clinicalsampleinformationandamplificationfragmentsize

序号No.名称Designation地区AreaGenBank登录号AccessionNo.扩增大小/bpAmplificationsize1PDS1S平顶山PingdingshanKY21105240732PDS2S平顶山PingdingshanKY21105341613LY1S平顶山PingdingshanKY21104141614XC1S许昌XuchangKY21105441105XC2S许昌XuchangKY21105541616XX1S新乡XinxiangKY21105641617JZ1S焦作JiaozuoKY21103841618LH1S漯河LuoheKY21103941619LH2S漯河LuoheKY211040416110ZMD2S驻马店ZhumadianKY211066416111ZMD3S驻马店ZhumadianKY211067416112ZMD4S驻马店ZhumadianKY211068411013ZMD5S驻马店ZhumadianKY211069411014ZMD7S驻马店ZhumadianKY211070411015ZMD8S驻马店ZhumadianKY211071411016ZMD9S驻马店ZhumadianKY211072411017ZMD10S驻马店ZhumadianKY211073416118ZMD11S驻马店ZhumadianKY211074416119ZMD12S驻马店ZhumadianKY211075416120NY1S南阳NanyangKY211042417921NY2S南阳NanyangKY211043416122NY3S南阳NanyangKY211044416123NY4S南阳NanyangKY211045411024NY5S南阳NanyangKY211046417925NY6S南阳NanyangKY211047416126NY7S南阳NanyangKY211048416127NY8S南阳NanyangKY211049411028NY9S南阳NanyangKY211050415829NY10S南阳NanyangKY211051411030XY1S信阳XinyangKY211057416131XY2S信阳XinyangKY211058416132XY3S信阳XinyangKY211059411033XY4S信阳XinyangKY211060411034XY5S信阳XinyangKY211061415835XY6S信阳XinyangKY211062416736XY7S信阳XinyangKY211063416137XY8S信阳XinyangKY211064411038XY9S信阳XinyangKY2110654110

2.2 S基因的演化分析

运用MEGA5.2软件对S基因的氨基酸序列进行进化分析。如图1所示，扩增的PEDVS基因片段均属于Group2，DR13毒株和CV777毒株属于Group1。Group2又进一步的被分为五个亚组，ZMD10/11S、PDS1/2S、NY9S和XY5S这几个PEDVS基因片段与GD-1、CHGD-01亲缘性较近，属于Subgroup2；LY1S、NY1/5S、XY2S与变异毒株BJ-2011-1、AH2012、AJ1102亲缘关系近，属于Subgroup3；扩增的S基因片段ZMD3/4/5/7/8/9S、XY1/4/6S、NY2/3/4/6/7/10S和LH2S与USA Colorado 2013变异毒株亲缘关系较近，属于Subgroup4；其他扩增的S基因片段与PEDV CH ZMDZY 11有更近的亲缘关系，属于Subgroup5。

2.3 S蛋白氨基酸变异分析

为了深入了解S基因的特性，运用MegAlign软件对所有扩增的S基因编码的S蛋白的氨基酸序列与参考毒株进行比对分析。结果显示：扩增的S基因片段之间核苷酸序列的相似性在96.0%～100%；编码的氨基酸序列的相似性在94.7%～100%；扩增的S基因片段与参考毒株之间核苷酸序列的相似性为84.6%～100%；编码的氨基酸序列的相似性为79.3%～100%。与经典毒株CV777、LZC相比，所有扩增的S基因编码的S蛋白在第55—58氨基酸位点均有5个氨基酸的插入，在第159—160氨基酸位点有2个氨基酸的缺失。与其他分离的PEDV不同的是，NY1/5S的S蛋白在第358—363氨基酸位点有6个氨基酸的插入，XY6S的S蛋白在第393—394氨基酸位点有2个氨基酸的插入。除了经典毒株CV777与LZC，所有扩增的S基因编码的S蛋白在第55—58氨基酸位点均有4个氨基酸的插入，在第159—160位氨基酸位点均有2个氨基酸的缺失。然而，扩增的XY4S、ZMD4/5/7/8/9S、NY4/8/10SS基因编码的S蛋白在第1 362—1 366 氨基酸位点有5个氨基酸的缺失，XY3/8/9S、XC1S在第161位以及第1 362—1 366 位氨基酸位点有6个氨基酸的缺失。XY4S、ZMD4/5/7/8/9S、NY4/8/10S、XY3/8/9S与XC1的S蛋白与其他毒株相比在C端有11个氨基酸的缺失。

PEDV的S蛋白是一个含有四个中和表位的一型糖蛋白。四个中和表位：COE(499—638 aa)、SS2(748—755 aa)、SS6(764—771 aa)与2C10(1 368—1 374 aa)。所有扩增的S基因片段的中和表位与代表毒株进行分析比对，结果显示：氨基酸的替换主要位于COE与2C10两个区域，中和表位SS2与SS6两个区域相对比较保守。在中和表位COE区域，LY1S有三个位点的氨基酸突变，分别如下：562位的赖氨酸突变为天冬氨酸，607位的丝氨酸突变为甘氨酸，608位的甘氨酸突变为颉氨酸。NY1S与NY5S有两个相同的突变，即：538位的苯丙氨酸突变为丝氨酸，608位的甘氨酸突变为颉氨酸。XY2S有四个突变，即：580位的赖氨酸突变为精氨酸，592位的丙氨酸突变为脯氨酸，607位的丝氨酸突变为天冬氨酸，608位的甘氨酸突变为丝氨酸。XC2、XX1S、LH1S与XY7S毒株有三个相同的突变，分别如下：520位的组氨酸突变为精氨酸，526位的异亮氨酸突变为苏氨酸，583位的赖氨酸突变为天冬酰胺。JZ1S有两个氨基酸突变，即：526位的异亮氨酸突变为苏氨酸，583位的赖氨酸突变为天冬酰胺。在中和表位2C10区域，很多扩增的S基因编码的S蛋白在1 371氨基酸位点或1 375氨基酸位点有一个突变。ZMD4/11S、LY1S、NY1/5S、XY2S与ZMD3S均在1 375氨基酸位点由丙氨酸突变为颉氨酸。XY3/4/8/9S、ZMD4/5S、NY4/8/10S、ZMD7/8/9S与XC1S毒株均在1 371氨基酸位点由谷氨酰胺突变为亮氨酸。然而，所有扩增的S基因编码的S蛋白在SS2与SS6两个中和表位没有一个氨基酸突变。

图1 PEDV S基因的进化树分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of PEDV S gene

3 讨 论

3.1 关于PEDV S基因扩增测序

目前，PEDV在中国流行并且很多学者已经报道PEDV变异毒株正在不断出现，经典毒株制作的PEDV弱毒疫苗可能对于新出现的PEDV变异毒株不具有完全的保护能力[12-15]。本研究中，2014年至2015年中国中部河南省各地区猪场腹泻病料中，扩增到38株PEDV的S全基因片段并测序。将扩增的S基因与参考毒株进行遗传演化分析。结果表明：所有扩增的S基因与新分离的变异毒株CH/ZMDZY/11、AH2012、USA Colorado 2013以及2011年后中国和美国分离的毒株亲缘关系很近，均属于Group2。遗传演化分析结果与先前的报道相似[16-17]，证明现今在河南省境内流行的PEDV毒株为变异毒株。

3.2 关于PEDV S基因进化树分析

另外，Group2又进一步被分为五个亚组，分别为Subgroup1、Subgroup2、Subgroup3，Subgroup4和Subgroup5。扩增的ZMD10/11S、PDS1/2S、NY9S、XY5SS基因片段与从中国南部分离出的GD-1、CHGD-01毒株亲缘相近，属于Subgroup2。LY1S、NY1/5S和XY2S属于Subgroup3，与中国北部、东部、中部分离的变异毒株BJ-2011-1、AH2012、AJ1102亲缘关系相近。进一步分析得出，ZMD3/4/5/7/8/9S、XY1/4/6S、NY2/3/4/6/7/10S与LH2S毒株与USA Colorado 2013毒株亲缘关系相近，属于Subgroup4[18]。其他扩增的S基因片段与中国中部分离的CH ZMDZY 11毒株亲缘关系相近，属于Subgroup5[19]。这些结果表明，本次从河南省扩增的38株PEDVS基因片段经历了不同的变异演化。

3.3 关于PEDV S蛋白氨基酸序列比对分析

对于中国PEDV野毒毒株S基因全长进行演化分析，将会有助于更好地了解中国河南省PEDV毒株的遗传演化关系。分析结果表明：所有扩增的PEDVS基因片段都有一个共同的重要特点，即编码的S蛋白有氨基酸的插入和缺失。扩增的38株PEDVS基因编码的S蛋白在第55—58位氨基酸位点均有4个氨基酸的插入，在第159—160位氨基酸位点均有2个氨基酸的缺失，与之前的研究报道相似[20]。

3.4 关于PEDV S蛋白免疫原性分析

PEDV的S蛋白属于Ⅰ型糖蛋白，包括四个中和表位，分别为COE(499—638 aa)、SS2(748—755 aa)、SS6(764—771 aa)与2C10(1 368—1 374 aa)。序列比对分析结果表明，扩增的38株PEDVS基因编码的S蛋白在中和表位SS2与SS6是保守的，未发生突变。与经典毒株CV777相比，在中和表位COE区域，XY2S、XC2、XX1S、LH1S、XY7S、LY1S 和JZ1S毒株均有氨基酸突变。在中和表位2C10区域，扩增的38株PEDVS基因中有20株编码的S蛋白有1个氨基酸突变。另外，XC2S、XX1S、LH1S与XY7S四株与美国分离的USA Colorado 2013毒株有相似的氨基酸突变[12]。有7株与BJ-2011-1、USA Colorado 2013、CH/ZMDZY/11相似，第1 375位的丙氨酸突变为颉氨酸[7，12，20]。PEDV的S蛋白是一个位于病毒表面的糖蛋白，并且诱导宿主产生中和抗体[6，20]。这些扩增的S基因编码的S蛋白的中和表位氨基酸的突变是否会影响机体中和抗体的产生，有待进一步的研究。

4 结 论

扩增河南地区2014—2015年采集病料中的38株猪流行性腹泻病毒(PEDV)的S基因并测序。分析显示所有PEDVS基因扩增片段与近年来中国和美国分离的变异毒株亲缘关系较近；扩增的PEDVS基因编码蛋白中存在氨基酸的插入和缺失；部分编码蛋白序列在C端有11个氨基酸的缺失；许多编码蛋白序列的中和表位COE和2C10区域存在氨基酸突变。

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