产气荚膜梭菌重组ε毒素突变体的免疫保护力评价

2018-05-07 08:54杜吉革李启红印春生彭小兵姚文生陈小云
畜牧兽医学报 2018年4期
关键词:荚膜产气梭菌

杜吉革,朱 真,薛 麒,李启红,印春生,彭小兵,姚文生,康 凯,陈小云

(中国兽医药品监察所,北京 100081)

产气荚膜梭菌旧称魏氏梭菌,是一种重要的人畜共患病原,常常诱发创伤性气性坏疽和人类食物中毒以及羔羊痢疾、牛羊坏死性肠炎、牛羊肠毒血症[1-6],给畜牧业造成巨大经济损失[7-12]。产气荚膜梭菌的主要致病因子是其分泌的外毒素,该菌可至少分泌18种外毒素,并通过这些外毒素引起人和动物发病[13]。根据产生的4种主要致死性外毒素α(CPA)、β(CPB)、ε(ETX)和ι(CPI)的种类,将该菌分为A、B、C、D、E五个毒素型[14]。产气荚膜梭菌病具有发病急、病程短且死亡率极高的特点[15],一旦发病,往往还来不及治疗就因外毒素中毒而发生猝死,因此免疫接种是防控该病的有效方法。目前,通过灭活梭菌培养物上清而制备的天然类毒素疫苗是预防该菌感染的主要疫苗。但该类疫苗制备过程繁琐,抗原成分复杂,有效抗原含量较低,免疫效果不尽理想。因此,筛选安全、有效、纯净的抗原,用于研制新型产气荚膜梭菌病疫苗,对预防该菌感染具有重要意义。

由B型和D型产气荚膜梭菌产生的ε毒素(ETX)[16],是该菌所有外毒素中毒力最强的毒素[17]。该毒素全长296个氨基酸,以毒素前体的形式分泌于菌体外[18]。毒素前体被宿主的胰蛋白酶、糜蛋白酶或梭菌自身的蛋白酶作用后,去除N端11~13个以及C端22~29个氨基酸,从而活化为成熟毒素[19-20]。ETX分子主要分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三个区域,分别在毒素与细胞受体结合过程、与细胞受体结合稳定性的维持以及细胞膜穿孔的形成过程中发挥着重要作用[21]。此外,ETX分子中有2条35个氨基酸的肽链同时跨过Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三个区域[22]。ε毒素的这些特性导致仅使用毒素的一个域作为疫苗候选抗原的策略(如α、β毒素的C末端[23-24])很难应用于该毒素的防控。因此,实现毒素的减毒甚至无毒以及构建相关减毒或无毒突变体,对于开发毒素基因工程亚单位疫苗及将其作为抗原组分的多价亚单位疫苗的研究和应用就显得尤为重要。已有的研究发现,106位组氨酸突变为脯氨酸的重组ETX基本是无毒的,且保留了良好的免疫原性[25-27]。此外,Ⅰ区域内的第29、30、36、196以及199位氨基酸的无毒单突变重组ETX也保留了较好的免疫原性[26,28-29]。

为了最大限度地保留天然毒素蛋白的完整性和空间构象,保持其免疫原性,同时避免因单个氨基酸突变在未来基因工程疫苗大规模生产中可能造成的生物安全隐患,本文同时对我国现行D型产气荚膜梭菌制苗用菌株(C60-2株)ETX基因的30、196和106位氨基酸位点进行突变,通过原核系统表达、纯化和鉴定,并对其毒力和免疫原性进行了研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

D型产气荚膜梭菌C60-2株、D型产气荚膜梭菌C60-2株天然毒素、D型产气荚膜梭菌抗毒素以及pET-30a(+)表达载体为本实验室保存;1.5~2.0 kg普通级健康日本大耳白兔和16~18 g ICR小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司;pEASY-Blunt Cloning Vector、感受态细胞Top10和BL21(DE3)购自北京全式金生物技术有限公司; Montanide ISA 206佐剂购自法国赛彼科(Seppic)公司;Ni-IDA亲和层析介质试剂盒、蛋白Marker、Western blot Marker、蛋白溶解液(50 mmol·L-1Tris-HCl, 10% Glycerol, 150 mmol·L-1NaCl, pH 8.0),均购自南京金斯瑞生物科技有限公司; 高保真PCR酶(KFX-401S)购自东洋坊公司;PremixTaqversion 2.0、DNA Marker购自TaKaRa公司。T4 DNA连接酶、DNA凝胶回收试剂盒购自Promaga公司;限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ购自NEB公司;抗His标签单抗、Bradford蛋白浓度测定试剂盒,购自碧云天生物技术有限公司;明胶缓冲溶液,LB培养基购自北京中海生物科技有限公司。

1.2 基因合成及密码子优化

以D型产气荚膜梭菌C60-2株ETX编码基因为模板,按大肠杆菌偏爱的密码子进行了优化设计和人工合成。同时,引入3个氨基酸点突变,分别是第30位酪氨酸突变为丙氨酸,第106位组氨酸突变为脯氨酸,第196位酪氨酸突变为丙氨酸。此外,在突变基因后添加6*His标签蛋白序列。基因合成由中美泰和公司完成,合成的基因称为GETXm3。

1.3 ETX突变体原核表达载体的构建

以人工合成的GETXm3基因为模板,采用引物对GETXm3-F/ GETXm3-R进行PCR扩增。其中上游引物GETXm3-F序列:5′-CGCCATATGAAAGAAATCTC-3′,其5′端引入限制性内切酶NdeⅠ位点(下划线部分)及保护性碱基;下游引物GETXm3-R序列:5′-CCGCTCGAGTTAGTGGTGATG-3′,其5′端引入限制性内切酶XhoⅠ位点(下划线部分)。PCR体系为50 μL。PCR反应条件:94 ℃预变性4 min;98 ℃变性10 s,56 ℃退火30 s,68 ℃延伸90 s,共33个循环;最后68 ℃延伸7 min。

扩增得到的目的DNA条带,经回收后,采用NdeⅠ/XhoⅠ双酶切消化,与经过相同酶切消化的pET30a(+)载体连接。将连接好的质粒转化Top10感受态细胞,挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中,37 ℃振荡培养过夜,提取质粒进行PCR和双酶切鉴定,鉴定结果为阳性的质粒送中美泰和公司测序,将测序正确的质粒命名为pET30a-GETXm3。

1.4 重组蛋白质的表达与鉴定

将pET30a-GETXm3质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,分别在37和16 ℃条件下用IPTG诱导表达,收集菌体,超声破碎后分别收集上清和沉淀,采用SDS-PAGE检测重组蛋白质的表达情况及其可溶性,将表达的目的蛋白质称为rETXm3。采用Western blot方法,以抗His标签蛋白抗体为一抗,对重组蛋白质做进一步的鉴定。

1.5 重组蛋白质的纯化及Western blot鉴定

按照Ni-IDA亲和层析介质试剂盒的使用说明书对菌体裂解上清中呈可溶性表达的目的蛋白质进行纯化,用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度,-80 ℃保存备用。将纯化后的目的蛋白质经SDS-PAGE电泳后转印至PVDF膜上,分别以抗His标签抗体和D型产气荚膜梭菌抗毒素血清为一抗,HRP标记的山羊抗鼠、山羊抗兔IgG为二抗进行孵育,按照底物显色试剂盒说明书进行显色,检测纯化的重组蛋白质与抗His标签抗体及D型产气荚膜梭菌抗毒素血清的反应情况。

1.6 重组蛋白质的毒力测定

已有的研究发现,产气荚膜梭菌ETX毒素首先以前体毒素形式分泌,当被蛋白酶(如胰酶、糜蛋白酶以及羧肽酶等)切除N端以及C端相应的氨基酸后,毒素被活化,从而挥发相应的生物活性[18-20]。活化的ETX对小鼠的半数致死量可达50 ng·kg-1 [30]。本文按照我国现行《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法,用终浓度为1%的胰酶对纯化的rETXm3在37 ℃条件下活化1 h。首先对抗原的免疫剂量和免疫途径进行优化,将16~18 g ICR小鼠随机分为9组,每组5只。分别用活化前和活化后的rETXm3静脉注射,注射剂量分为1、10、100 μg 3个梯度。同时设置胰酶消化液(终浓度为1%)以及蛋白溶解液两个阴性对照和1个MLD的天然毒素阳性对照。其中,样品均用明胶缓冲液进行稀释,注射的液体总体积为350 μL,观察2 d,记录小鼠的存活状态。

1.7 免疫原性分析

1.7.1 免疫程序 将合适浓度的纯化rETXm3与Montanide ISA 206佐剂以体积比1∶1的比例配制成rETXm3终质量浓度为50 μg·mL-1的疫苗,置4 ℃保存备用。用体重1.5~2.0 kg健康家兔4只,各颈部皮下注射疫苗,2.0 mL·只-1,免疫后14 d,以相同剂量、相同途径进行二次免疫。另取灭菌PBS与Montanide ISA 206佐剂以体积比1∶1的比例制备对照疫苗,各颈部皮下注射相同条件的健康家兔4只,2.0 mL·只-1,作为对照组。

1.7.2 血清中和抗体效价测定 分别在一免后14 d以及二免后21 d,对试验组及对照组所有兔经耳缘静脉采血,分离血清备用。按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)三部中规定的方法进行血清中和效价测定[31]。

1.7.3 攻毒试验 二免后21 d,对免疫组及对照组所有家兔经耳缘静脉各注射1 MLD的天然毒素进行攻毒,观察5 d,记录家兔的死亡情况。根据免疫组及对照组家兔的死亡情况,判定试验疫苗的免疫保护效力。

2 结 果

2.1 ETX毒素突变体原核表达载体的构建

采用引物GETXm3-F/ GETXm3-R进行PCR扩增,扩增片段经酶切后克隆至pET-30a(+)载体。获得的重组质粒经双酶切后电泳观察,结果如图1所示。酶切后出现大小约5 kb的载体DNA片段,以及大小约920 bp的目的基因片段,与预期相符。测序结果表明,插入的外源基因序列是正确的。将此重组质粒命名为pET30a-GETXm3。

2.2 ETX毒素突变体的原核表达鉴定

将重组表达质粒pET30a-GETXm3转化至BL21(DE3)感受态细胞并诱导表达。SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,表达的目的蛋白质相对分子质量约为39 ku,大小与预期相符。表达的rETXm3重组蛋白质在BL21(DE3)菌体中以可溶性和包涵体两种形式存在(图2)。图2a为重组蛋白质表达的SDS-PAGE鉴定结果,如图所示,37 ℃、诱导4 h后,重组蛋白质的表达量以及可溶性均优于其他诱导条件。为此,确定目的蛋白质最适诱导表达条件为37 ℃,诱导表达4 h,收获细胞裂解上清。图2b为重组蛋白质的Western blot鉴定结果,表达的目的蛋白质能与抗His标签抗体发生反应,证明目的蛋白质含有His标签,与预期相符。

1. DL5000 DNA相对分子质量标准; 2. 重组质粒pET30a-GETXm3 的NdeⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定1. DL5000 DNA marker; 2. pET30a-GETXm3 digested with NdeⅠand XhoⅠ图1 原核表达重组质粒pET30a-GETXm3的酶切鉴定Fig.1 Identification of recombinant prokaryotic expression plasmids pET30a-GETXm3

a.重组蛋白质表达的SDS-PAGE鉴定;b.重组蛋白质与抗His单抗反应的Western blot;M1. 蛋白质相对分子质量标准;M2. Western blot蛋白质相对分子质量标准;PC1. BSA (1 μg);PC2. BSA (2 μg);NC.未诱导细胞裂解物; 1. 细胞裂解物(15 ℃、16 h诱导);2. 细胞裂解物(37 ℃、4 h诱导);NC1. 未诱导细胞裂解上清;NC2. 未诱导细胞裂解沉淀;3. 细胞裂解上清(15 ℃、16 h诱导); 4. 细胞裂解沉淀(15 ℃、16 h诱导); 5. 细胞裂解上清(37 ℃、4 h诱导); 6. 细胞裂解沉淀(37 ℃、4 h诱导)a. The identification of recombinant protein expression by SDS-PAGE; b. The identification of recombinant protein with anti-His monoclonal antibody by Western blot; M1. Protein marker; M2. Protein marker of Western blot;PC1. BSA (1 μg); PC2. BSA (2 μg); NC. The cell lysates without induction; 1. The cell lysates induced with IPTG for 16 h under 15 ℃; 2. The cell lysates induced with IPTG for 4 h under 37 ℃; NC1. The supernatant of cell lysates without induction; NC2. The precipitation of cell lysates without induction; 3.The supernatant of cell lysates induced with IPTG for 16 h under 15 ℃; 4. The precipitation of cell lysates induced with IPTG for 16 h under 15 ℃; 5. The supernatant of cell lysates induced with IPTG for 4 h under 37 ℃; 6. The precipitation of cell lysates induced with IPTG for 4 h under 37 ℃图2 rETXm3的原核表达与鉴定Fig.2 Prokaryotic expression and identification of rETXm3

2.3 ETX毒素突变体的纯化与鉴定

按照Ni-IDA亲和层析介质试剂盒说明书对rETXm3进行纯化,收集纯度较高的洗脱液进行透析,最终获得的蛋白质质量浓度为0.302 mg·mL-1,纯度可达90%以上,结果见图3a。将纯化后的rETXm3经SDS-PAGE后转移到PVDF膜上进行Western blot检测。结果rETXm3能够与抗His标签抗体(图3b)以及D型产气荚膜梭菌抗毒素血清(图4)发生反应。

a.纯化蛋白的SDS-PAGE鉴定;b.纯化蛋白与抗His单抗反应的Western blot鉴定; M1. 蛋白质相对分子质量标准; M2. Western blot蛋白质相对分子质量标准; 1. BSA; 2. 纯化后的rETXm3a. The identification of purified recombinant protein by SDS-PAGE; b. The identification of purified recombinant protein with anti-His monoclonal antibody by Western blot; M1.Protein marker; M2. Protein marker of Western blot; 1. BSA; 2. rETXm3 after purification图3 rETXm3的纯化与鉴定Fig.3 Purification and identification of rETXm3

2.4 产气荚膜梭菌ETX突变体的毒性分析

未活化和经过胰酶活化的rETXm3,分别以1、10、100 μg的剂量注射小鼠,结果注射组以及蛋白溶解液、胰酶消化液两个阴性对照组小鼠,在注射后21 d内均存活,未见任何异常。注射1个MLD天然毒素(0.000 25 mL)的小鼠,在注射24 h内全部死亡,说明重组表达的产气荚膜梭菌ETX毒素突变体已成功减毒,即使经过胰酶活化后,对小鼠依然是无毒的。

M.蛋白质相对分子质量标准;1.纯化后的rETXm3 M. Protein molecular weight marker; 1. rETXm3 after purification图4 rETXm3与D型产气荚膜梭菌抗毒素血清的反应Fig.4 Interaction of rETXm3with antitoxin serum of Clostridium perfringens type D

2.5 血清中和抗体效价的测定

经血清中和法测定,rETXm3免疫组的D型产气荚膜梭菌毒素中和抗体效价在一免后均大于50 MLD(即0.1 mL家兔血清可中和50 MLD以上的D型产气荚膜梭菌毒素),最高达60 MLD;二免后中和抗体效价均大于400 MLD,最高达450 MLD(表1)。以上试验结果表明,制备的产气荚膜梭菌ETX毒素突变体rETXm3的免疫效力远高于现行《中华人民共和国兽药典》的规定,是优良的制苗用候选抗原。

表1rETXm3免疫兔血清对D型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价

Table1ThetitersofneutralizationpotencyagainsttoxinsofClostridiumperfringenstypeDgeneratedbyrETXm3inrabbits

分组GroupsrETXm3免疫组RabbitsimmunizedwithrETXm3佐剂免疫组Rabbitsimmunizedwithadjuvant兔编号NumberP1P2P3P4C1C2C3C4一免后中和抗体效价(MLD)Theserumneutralizationtitersafterfirstimmunization(MLD)506060550000二免后中和抗体效价(MLD)Theserumneutralizationtitersaftersecondimmunization(MLD)4004254504200000

2.6 攻毒保护试验结果

二免后21 d,对所有rETXm3免疫组和佐剂免疫对照组的家兔,经耳缘静脉注射1 MLD剂量的天然毒素进行攻毒,结果佐剂免疫对照组家兔在攻毒后5 d内全部死亡,rETXm3免疫组家兔全部健活,未见任何不良反应。试验结果表明,产气荚膜梭菌ETX毒素突变体rETXm3能产生可靠的免疫攻毒保护效力。

3 讨 论

作为一种重要的人畜共患病原,产气荚膜梭菌不仅严重威胁着人类的健康,而且对畜牧业造成了巨大经济损失。随着研究的深入,与产气荚膜梭菌密切相关的主要致死性外毒素的结构和致病机制越来越清晰,致死性外毒素的部分无毒区域(α、β以及ι毒素的C末端[23-24])或者无毒突变体(ε[25-26, 28]和θ毒素[32])作为亚单位疫苗抗原已经被证实能够有效预防相应的毒血症。作为一种潜在生物武器的ε毒素,其毒力仅次于肉毒毒素和破伤风毒素。该毒素能够导致家禽和家畜特别是反刍动物强烈的肠毒血症,给畜牧业造成严重的经济损失[11]。因此,加强ε毒素防治方面的研究非常必要,尤其需要关注其生物安全性。李箐[33]通过原核系统获得了具有可溶性的重组ε毒素,该蛋白具有较强的毒力,在亚单位疫苗的制备过程中同样涉及外毒素的灭活,导致存在毒素外泄或灭活不彻底等生物安全隐患。

在无毒重组ε毒素亚单位疫苗的研究中,经典的无细胞毒性的突变体为第106位组氨酸突变为脯氨酸的重组ε毒素蛋白,其安全性和抗原保护性已经得到充分的验证[25-27]。其中,李箐[33]对ε毒素的第106位组氨酸、第111位色氨酸及第199位苯丙氨酸的突变体进行了研究。结果表明,rETXH106P的安全性最高。ETX对犬的肾上皮细胞(MDCK)的CT50为(37.73±12.55) ng·mL-1,而质量浓度为100 μg·mL-1的rETXH106P对MDCK细胞仍无毒力。根据已有的文献报道,50 ng·mL-1的天然ETX即能引起小鼠死亡。为此,本研究直接选用小鼠来检测rETXm3的毒性,结果发现质量浓度为100 μg·mL-1的rETXm3对小鼠仍无毒力作用。此外,作为一个较为经典的无细胞毒性的突变体rETXH106P,该蛋白的可溶性表达量非常低[33-34],如果需要大量生产会增加纯化的难度。然而,本研究中的无毒重组蛋白rETXm3可溶性表达量较高,可溶比例可达到40%,这可能由于按照大肠杆菌偏爱的密码子进行优化引起的,或者是其余两个点突变更利于rETXm3的可溶表达。用抗His抗体进行Western blot试验结果发现,未纯化的rETXm3显色膜上出现杂带,这可能是抗体的浓度过高引起的(图2b)。对于纯化后的rETXm3,用抗His抗体进行Western blot时出现单一的条带(图3b),而用D型产气荚膜梭菌抗毒素血清作为一抗时,显色膜上出现了两条明显的条带(图4)。因为D型产气荚膜梭菌抗毒素血清是通过灭活的D型产气荚膜梭菌培养物免疫日本大耳白兔制备,抗原不仅含有类毒素,还含菌体的其他成分。为此,笔者认为在纯化的rETXm3中残留了一部分原核生物的共有抗原,才导致图4中出现两条明显的条带。

目前,活化ETX毒素可以采用胰酶、糜蛋白酶以及羧肽酶,3种酶活化ETX的机制基本相同,均为切除ETX毒素前体蛋白的N端以及C端相应的氨基酸,使其活化。但是不同的酶活化后ETX毒素对小鼠的LD50却存在很大差异,范围从50至320 ng·kg-1。目前大多数的研究论文,以及我国现行《中华人民共和国兽药典》(2015年版)均采用胰酶进行活化,为使本研究的数据与其他研究人员的数据更具有可比性,故本研究采用了胰酶进行活化。

为了进一步降低未来基因工程疫苗大规模生产中可能存在的ε毒素基因回复突变带来的生物安全风险,除了第106位氨基酸的点突变外,本研究同时还对ε毒素的第30位和196位氨基酸进行了突变。其中,第30位和196位氨基酸均位于ETX的Ⅰ结构域,可能和毒素分子与受体的结合有关[29]。第30位氨基酸进行突变,能够降低ε毒素的毒力,但突变后的毒素抗原性没有得到深入研究。最近的研究发现,与rETXY196E相比,添加C-末端氨基酸的rETXY196E(rETXY196E-C)毒力更低,且具有良好的免疫原性[28]。然而,添加C-末端氨基酸的重组突变体仍然有被蛋白酶重新切掉的可能,存在一定的安全风险。本文的研究发现,同时有三个点突变的重组毒素rETXm3,在本文的检测浓度范围内对小鼠没有毒力作用,具有很高的安全性,但仍然保留了良好的免疫原性。由于ETX分子中有2条35个氨基酸的肽链同时跨过Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三个区域[22],导致仅使用ETX分子的一个域作为疫苗候选抗原的策略(如α、β毒素的C末端[23-24])很难应用于该毒素的防控。因此,对于ε毒素的突变体研究通常聚焦在突变个别氨基酸位点,而直接去掉某个氨基酸的研究还没有报道。为此,制备免疫原性良好的缺失某些关键氨基酸位点的无毒ETX分子将是我们后续研究的重点。

由于致病的梭菌种类较多,且常混合感染,导致梭菌病的预防多采用联苗,以达到一针多防的目的。该类疫苗均为天然毒素经甲醛脱毒后制备的类毒素疫苗,其抗原成分复杂,有效抗原量较低,导致效果不理想。特别是联苗中每种菌株的类毒素免疫量均较高,组合后的总免疫量过大,容易引起动物的应激反应。根据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)三部的规定,在此类疫苗检验中,对D型产气荚膜梭菌毒素的兔血清中和效价达到3 MLD即可判为合格。虽然该标准为疫苗的最低标准,但从中国兽医药品监察所历年的兽用生物制品监督检验结果来看,目前我国该类疫苗的免疫效力不容乐观,疫苗抽检不合格的情况时有发生[35]。彭小兵等对自2006 年至2015年间的此类疫苗检验结果的统计发现,以血清中和法检验后效力不符合规定的产品共有33批,其中β毒素组分效力不符合规定(低于1 MLD)的比例最高,约为72.7%[36]。然而,鉴于此类联苗免疫剂量的限制,无法再大幅度增加β类毒素的比例。为此,产气荚膜梭菌毒素亚单位疫苗的研制显得极为重要。在一定的范围内,我们可以最大幅度地增大免疫原性较差的毒素抗原,从而提高联苗总体的免疫保护作用。而本研究中制备的rETXm3一免兔血清中和效价可达50 MLD,二免后甚至可达400 MLD,效果明显优于目前的商品化疫苗。这说明ε毒素的30、106和196氨基酸突变后,毒力基本消失,但仍保留了良好的免疫原性,是我国现行D型产气荚膜梭菌毒素疫苗升级换代的理想候选疫苗抗原。

4 结 论

优化设计并克隆D型产气荚膜梭菌ε毒素编码基因,在原核表达系统成功表达。ε毒素的重组蛋白质为可溶性表达,且能与该菌ε毒素抗血清反应;重组蛋白质免疫兔血清对该菌ε毒素的中和效价较高;用该菌ε毒素攻毒后,对照小鼠全部死亡,重组蛋白质免疫组得到保护。可见产气荚膜梭菌重组ε毒素突变体无毒力且保留了良好的免疫原性。

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