雷诺定受体2在抑郁大鼠心房颤动中的作用*

储睿 殷瑛 周兴宇 石少波 朱刚艳

雷诺定受体2(RyR2)是位于心肌细胞肌浆网上重要的钙离子释放通道。Voigt等[1]研究发现心房颤动(简称房颤)发生时，RyR2功能改变，可介导肌浆网自发性钙释放增加，并引起持续性房颤。近年来临床数据证实焦虑、愤怒、压力、抑郁等应激相关情绪是房颤的独立危险因素[2]。焦虑、抑郁等直接影响心房电活动，触发房颤，其具体机制尚不清楚。笔者探讨RyR2在抑郁大鼠房颤发生中的作用，并运用RyR2拮抗剂丹曲林进行干预，旨在寻找房颤治疗新靶点。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 成年雄性SD大鼠70只，体重180～220 g，由武汉大学人民医院动物实验中心提供。所有动物在实验室适应性喂养1周后，采用完全随机设计方法将大鼠分为4组：正常对照组(CTL组,n=15),正常丹曲林组(DAN组,n=15)，抑郁组(CUMS组,n=20),抑郁加丹曲林(C+D组,n=20)。CTL组和CUMS组每日腹腔注射2 ml/kg生理盐水，其余两组同时每日腹腔注射1%丹曲林(Sigam公司)药液2 ml/kg，连续4周。CUMS组和C+D组在给药的同时，给予不可预见的慢性温和刺激造成抑郁。

1.2抑郁模型制作 给予慢性不可预见性温和刺激(chronic unpredicted mild stress，CUMS)建立抑郁模型：禁食24 h，禁水24 h，夹尾1 min(夹在大鼠尾根部约1 cm处)，鼠笼倾斜45° 24 h，潮湿垫料24 h，限制行为24 h，4℃冰水游泳5 min，42℃热水游泳5 min，持续光照24 h，捕食者声音30 min，摇晃鼠笼15 min。 将上述11种刺激随机安排到4周中，每天一种刺激。同种刺激不连续出现，使得动物不能预料刺激的发生，避免发生适应[3-4]。于实验前、实验中第7、14、21、28天测量大鼠体重。

1.3行为学评价 从第5周开始进行糖水消耗试验及强迫游泳实验(forced swimming test，FST)进行评估实验动物是否抑郁。糖水消耗实验参考文献[5]，在实验前三天训练大鼠适应饮用糖水。每个鼠笼同时放置2个水瓶，第1天，两瓶均装1%的糖水：第二天，一瓶装1%的糖水，一瓶装纯水：随后禁水24 h，再进行大鼠的基础糖水/纯水消耗量。同时给予每只大鼠事先定量的1%糖水和纯水。2 h后，取两瓶水称量。计算动物的糖水偏爱百分比[糖水偏爱=糖水消耗/(糖水消耗+纯水消耗)×100%]。

FST参照文献[6],将大鼠放入直径为23 cm、高60 cm的测试桶中，桶中的水温为25℃±1℃。进行此实验前预先强迫大鼠游泳15 min，然后取出，用毛巾擦干身体上的水放回鼠笼。禁食但不禁水12 h后，再次强迫游泳6 min，前2 min让大鼠适应环境，记录后4 min中不动状态的时间。每只大鼠进行实验前更换桶中的水。

1.4离体灌流 实验动物在饲养4周结束，进行行为学评价后，开始进行离体灌流实验。具体方法如下：首先经腹腔注射肝素钠(华北制药有限公司)400 U对实验动物进行抗凝，10 min后腹腔注射2%苯巴比妥钠40 mg/kg，待大鼠深度麻醉后以颈椎脱臼处死。从胸骨左缘约1 cm处开胸，充分暴露心脏及主动脉根部，迅速取出心脏,置于100%氧饱和的4℃生理盐水中洗净残血，剪去心包膜及周围结缔组织，继而将灌流管插入主动脉根部连接灌流设备，经主动脉逆行灌注提前配置的台式液。灌流液保持37℃±0.5℃，并给予95%O2、5%CO2进行通气，灌流速度维持7～9 ml/min,灌注压维持80 mmH2O。对心脏进行修剪处理，剪去无法恢复自主节律的心脏组织。

1.5离体电生理研究 离体心脏组织在Langendorff装置中静待15 min，观察心脏的自主节律，待心脏自主节律稳定后，将刺激电极放置于右房，AgCl电极放置于左房位置记录心房的单相动作电位(monophasic action potential，MAP)，MAP采用PowerLab放大器记录，并采用LabChart7.0软件分析。①有效不应期(effective refractory period，ERP)测定：连续发放8个起搏刺激波S1后发放早搏刺激波S2(S1S2=250 ms)。每次递减10 ms的降低S1S2间期，如果S2能诱发出动作电位，则继续以10 ms减少S1S2间期,当S2不能诱发出动作电位时，则将S1S2增加10 ms，然后以2 ms递减直至S2不能诱发出动作电位，此时S1S2间期即为左房的ERP。②连续发放8个起搏刺激S1(S1S1)分别给予250，200，150和100 ms周长(cycle length，CL)程控刺激，测心房的动作电位恢复90%的时程(APD90)。③运用Burst刺激诱发房颤，刺激电极和记录电极分别放置于右房和左房，刺激电极给予50 Hz持续时间2 s，间隔时间2 s的Trian刺激，总的刺激时间小于2 min，房性心律失常持续时间超过2 s即为可诱发。

1.6RyR2和磷酸化(P)-RyR2(2808)受体蛋白表达检测 取实验动物心房组织，迅速将标本放置于液氮中冷藏，防止蛋白变性，并置于-80℃冰箱冷冻保存至检测。按照蛋白抽提试剂盒说明书分离提取蛋白,配置相应浓度的PAGE胶，电泳后将蛋白转移至PVDF膜上，用5%的脱脂奶粉封闭，4℃孵育一抗过夜：RyR2 、P-RyR2(2808)。TBST洗涤后加入相应的氧化物酶(HRP)标记的二抗孵育，用ECL显影定影。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为上样内参，计算上述蛋白的相对表达量。抗体皆购买于Abcam公司，PVDF购于Millipore公司，HRP和GAPDH内参购买于杭州贤至生物有限公司。

1.7数据处理 用SPSS 21.0软件分析统计数据，计量资料用均数±标准差表示。两组间比较采用两个样本独立t检验，多组之间的比较用单因素方差分析；计数资料用百分率表示，两组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有显著性。

2 结果

4周后，60只实验动物存活，CTL组、DAN组、CUMS组和C+D组最后分别入选13、14、15、18只大鼠，实验动物死亡率为14.3%。CTL组和DAN组大鼠在进行FST过程中死亡；CUMS组和C+D组大鼠在进行抑郁刺激过程中死亡。

2.14组动物体重和行为学结果比较 实验前，各组大鼠之间体重无差异，4周后，CUMS组体重增加较其他组少。4周后，CUMS组总的液体消耗量无明显变化而糖水消耗量明显减少，说明动物快感减少；C+D组糖水偏好百分比有所升高。CUMS组FST中静止时间明显长与其他组，C+D组实验结果有所改善。CTL组与DAN组各指标间无显著差异(P>0.05)。见表1。

2.2离体电生理结果 CTL组与DAN组之间ERP和APD90无差异(P>0.05)。与CTL组和DAN组比较，CUMS组中的ERP和APD90都减少(P<0.01)，ERP/ APD90显著减少；C+D组ERP和APD90变化幅度较小(P<0.05)。与CTL和DAN组比较，C+D组上述指标降低；与CUMS组比较，C+D组，上述指标有所升高。见表2。

表1 4组动物体重和行为学评价结果比较

注：前=指开始进行4周刺激前；后=指4周刺激结束后；与CTL组比较,*P<0.05；与C+D组比较,#P<0.05

表2 4组动物相关电生理指标结果比较

注：ERP=有效不应期；APD90=90%动作电位时程；与CTL组比较：*P<0.05；与C+D组比较：#P<0.05；与CTL组和DAN组比较，&P<0.05

CUMS组大鼠房颤诱发率明显高于其他组(P<0.05)；CTL组与DAN组无明显差异(0 vs 0，P>0.05)；C+D组虽然可以诱发房颤，但房颤诱发率低于CUMS组(4/10 vs 10/10,P<0.05)，而且停止Burst后，房颤自行停止时间较CUMS组短。见图1。

图1 4组Burst刺激下心电图

2.3蛋白表达水平检测 各组总RyR2受体表达量无显著差异(0.64±0.12 vs 0.62±0.08 vs 0.58±0.09 vs 0.59±0.10，P均>0.05)；与CTL组比较，CUMS组P-RyR2(2808)表达量明显增加(0.64±0.11 vs 0.19±0.08，P<0.01)，C+D组的P-RyR2(2808)较CUMS组有所减少(0.48±0.10 vs 0.64±0.11，P<0.01)，CTL组和DAN组两者之间无明显差异(0.19±0.08 vs 0.21±0.06，P>0.05)。见图2。

图2 4组动物RyR2受体、P-RyR2(2808)表达量

3 讨论

国内外动物实验发现抑郁大鼠体内多项电生理指标异常，房颤诱发率增加，临床上也有相似的发现[7-8]。有研究表明，房颤发生时，RyR2功能改变，其介导的自发性钙释放增加，并引起持续性房颤[9-10]。RyR2是心肌细胞内肌质网(sarcoplasmic reticulum，SR)上重要的钙离子释放通道，可影响心肌细胞内游离钙离子浓度[11-12]。位于肌浆网上的RyR2功能异常可能是抑郁大鼠易于诱发房颤的重要原因。

本文旨在探究RyR2在抑郁大鼠房颤中的作用，并运用RyR2拮抗剂丹曲林进行干预，为房颤特别是应激诱导房颤的治疗提供新的指导。本实验采用目前国内外普遍接受的慢性应激抑郁模型，后期结果显示，抑郁大鼠活动度下降，体重增加减慢，糖水消耗量减少，FST静止时间增加；ERP反应心肌细胞膜去极化能力，而APD主要反映复极化速度；一般情况下，ERP/ APD90比值减小有利于心律失常的发生[13]。本研究中发现抑郁导致大鼠ERP/ APD90比值减小，并且房颤诱发率明显增加。抑郁模型中RyR2的S2808明显被磷酸化，丹曲林可以改善这种异常磷酸化；CTL与DAN组中上述蛋白无明显变化。文献表明丹曲林对正常离体心肌细胞肌浆网的RyR2无作用[14-15]。正常情况下，首先兴奋冲动传导到心肌细胞膜，激活细胞膜上钙诱导钙释放(Ca2+induced Ca2+release，CICR)，继而为心肌收缩肌质网提供钙离子,引发心肌细胞兴奋收缩耦联(Ca2+induced Ca2+release，ECC)过程[16]。RyR2位于心肌细胞肌质网上钙离子释放通道，主要影响胞质内钙离子浓度。蛋白激酶A(protein kinase A; PKA)和钙调蛋白(calmodulimⅡ, CaMⅡ)分别可以过磷酸化RyR2上的ser2808，导致其功能异常出现舒张期钙漏[17-19]。

所以有理由推测RyR2功能异常是抑郁患者易于发生房颤的重要机制之一。本研究中抑郁组ser2808位点被过磷酸化，而用丹曲林治疗后过磷酸化情况好转。抑郁等应激刺激导致大鼠心脏RyR2受体功能异常，加用丹曲林可能通过阻断抑郁大鼠心肌肌浆网上功能异常RyR2受体，使得钙释放减少，从而减少大鼠房颤发生率，起到保护作用。

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