金纳米簇荧光探针对盐酸小檗碱测定研究

李志英, 刘 倩, 葛 超, 张海容

(1.忻州师范学院化学系 山西忻州 634000;2.忻州师范学院生化分析技术研究所,山西忻州 034000)

金纳米簇(AuNCs)由于尺寸小、生物相溶性好、光学稳定性好、无毒等优点而得到广泛应用。而AuNCs作为荧光探针展现出的独特光学特性，使其在生物检测和医学诊断中表现出了很好的前景[1]。

小檗碱是黄连、黄柏等中药中含量最多的生物碱。研究表明其具有局部麻醉、抗心律失常、治疗原发性高血压，对痢疾杆菌、链球菌等有较强的抑制作用，并有增强白血球吞噬作用，临床主要用于肠道感染，有较强的体内外抗肿瘤活性[2]。而盐酸小檗碱含量测定是衡量黄连质量的重要指标，其测定方法主要有高效液相色谱法[3 - 5]、薄层色谱法[6 - 7]、双波长扫描法[8]、SDS法[9]、毛细管区带电泳[10]等。本实验经吐温20增敏的金纳米簇(AuNCs)具有很高的稳定性和优良的光学性能，盐酸小檗碱与AuNCs作用使AuNCs团聚，荧光强度降低，据此，建立了AuNCs荧光探针测定盐酸小檗碱的新方法。方法简便、准确、快速，重复性好。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

F-4600荧光光度计(日本，日立公司)；Tecnai G2F205-TWIN透射电子显微镜(美国，FEI公司)；FTIR8400傅立叶变换-红外光谱仪(日本，岛津公司)。

HAuCl4·4H2O (国药集团化学试剂有限公司)；2-巯基苯并噻唑(天津市光复精细化工研究所) ；盐酸小檗碱(Be -H，国药集团化学试剂有限公司)。实验用水为二次蒸馏水。

盐酸小檗碱片(东北制药集团沈阳第一制药有限公司)；黄连、黄柏均购自于山西省忻州市五台山大药房。

1.2 实验方法

1.2.1AuNCs的合成分别准确吸取15 mL 0.4 g·L-1的HAuCl4溶液，20 mL 1.0×10-3mol·L-1的D -甘露糖溶液，10 mL 1.0×10-2mol·L-1的2-巯基苯并噻唑溶液，置于100 mL的锥形瓶中，摇匀。将锥形瓶放入数控超声波清洗器中，设置温度为40 ℃、水位高为80 cm、功率为8 0Hz、超声50 min，即制得AuNCs。

1.2.2盐酸小檗碱(Be-H)的测定精确吸取0.5 mL AuNCs溶液，1 mL吐温20溶液，2 mL pH=7的乙酸缓冲溶液，加入不同浓度的Be-H溶液于10 mL的比色管中，用二次蒸馏水定容，在激发波长和发射波长为346/532 nm处测定荧光强度F。计算:ΔF=F0-F,其中F0为未加Be-H时体系的荧光强度。

2 结果与讨论

2.1 AuNCs的透射电镜和红外光谱表征

由图1透射电镜(TEM)图可以看出，制备的AuNCs为比较规则的球形，直径为1.7～1.9 nm。由图2红外(IR)光谱图可知：D -甘露糖在2 950 cm-1的O-H 伸缩振动吸收峰向高波数方向移动；1 760 cm-1为C=O的伸缩振动吸收峰，690 cm-1为C-H的峰，D -甘露糖分子和AuNCs均含有两种类型的羧基，但AuNCs均减弱。

图1 AuNCs的透射电镜(TEM)图Fig.1 TEM image of AuNCs

图2 AuNCs和原料的红外(IR)光谱图Fig.2 IR spectra of AuNCs and ram material

2.2 AuNCs和实验体系的荧光光谱

分别配制1.0×10-3mol·L-12-巯基苯并噻唑溶液，1.0×10-4mol·L-1D -甘露糖溶液，一定浓度AuNCs溶液，1.0×10-5mol·L-1的Be-H溶液，在室温下放置20 min后，在激发波长为346 nm，发射波长为532 nm下测量各自的荧光强度。从图3曲线1可知，2-巯基苯并噻唑发射波长441 nm，曲线2说明D -甘露糖没有荧光，由曲线3可知AuNCs发射波长为532 nm，说明原料对AuNCs的荧光没有影响。图4曲线1为AuNCs，曲线2为AuNCs-Be -H的体系，说明Be -H可使AuNCs荧光猝灭，曲线3说明Be -H在532 nm处没有荧光。

图3 AuNCs体系的荧光光谱图Fig.3 The fluorescence spectra of AuNCs system

图4 测定体系的荧光光谱Fig.4 The fluorescence spectra of measurement system

2.3 反应机理

通过D -甘露糖还原法制备的AuNCs其溶液在532 nm波长处有荧光，粒子外层被过量的D -甘露糖所包围而显一定负电性，稳定剂2-巯基苯并噻唑通过Au-S键而使粒子也带上负电，它容易和正电荷物质发生静电作用，使AuNCs粒径变大，随着粒径的增大，AuNCs荧光强度也随之降低。由于电性关系，Be -H与AuNCs作用，导致AuNCs荧光强度降低。据此，可以实现对Be -H的测定。

图5 AuNCs和盐酸小檗碱的作用机理Fig.5 The mechanism of interaction between AuNCs and the berberine hydrochloride

2.4 AuNCs对Be -H的选择性

为了确认AuNCs对Be -H的选择性，对Be -H及其它一系列有机物及中药中常见物质的干扰进行测定。由图6可知，在1.0 ×10-6mol·L-1相同浓度下，Be -H可以跟AuNDs作用，使其荧光猝灭。F/F0值的巨大差异表明了AuNCs对Be -H的良好选择性。

2.5 表面活性剂的种类及用量的选择

图6 AuNCs对不同物质的响应Fig.6 Response of AuNCs to different compounds

根据实验方法，分别试验了表面活性剂CTMAB、OP乳化剂、吐温80、吐温60、吐温20、SDS表面活性剂对AuNCs荧光强度的影响。结果表明吐温20的增敏效果最好,所以本实验选定吐温20为增敏剂。同时准确吸取不同浓度的1∶5 000(V/V)的吐温20溶液进行实验，结果表明吐温20用量为1 mL时ΔF最大，所以本实验选用体积比为1∶5 000的吐温20溶液1 mL。

2.6 pH对体系的影响

以乙酸缓冲溶液为介质，调节测定体系的pH，研究pH对体系的影响。ΔF随pH的升高先增大后减小，当pH=7时，ΔF最大，故选择pH=7的乙酸缓冲体系为反应介质。

2.7 反应时间和温度对体系的影响

体系在5 min后反应完全，并且在30 min内ΔF基本不变，为方便测定故实验选择在10 min后测定。设定不同的温度：20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃，进行反应7 min，用流水冷却3 min。结果表明：不同温度条件下ΔF保持相对稳定,故实验选择在室温下进行。

2.8 标准曲线与检出限

按实验方法配制0、0.05、0.06、0.08、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0 μmol·L-1Be -H溶液，以未加Be -H溶液的空白溶液作参比，于激发波长346 nm处测定荧光强度。实验结果表明，Be -H的浓度在5.0×10-8～4.0×10-6mol·L-1范围内的线性回归方程为：ΔF=332.1c+99.7(c:μmol·L-1)，相关系数r2=0.9935。求得其标准偏差(S)为0.854，利用3S/K公式求得检出限为7.7×10-9mol·L-1。

2.9 样品的测定

取盐酸小檗碱片10粒,研细,称取40 mg细粉至烧杯中，加沸水适量使其溶解，冷却至室温，过滤后，移取滤液1 mL定容到100 mL容量瓶中。中药的处理：称取过筛的中药细粉2 g，加入40 mL无水乙醇和20 mL二次蒸馏水，在70 Hz功率下，超声提取数次，过滤，滤液定容到100 mL容量瓶中[11]。按实验方法测定，结果如表1。

表1 样品测定结果和回收率

3 结论

本实验在水溶液中以2-巯基苯并噻唑为稳定剂，D -甘露糖为还原剂，HAuCl4为原料，在80 Hz的超声波下制备AuNCs，用荧光光谱研究了经吐温20增敏的AuNCs作为荧光探针对中药盐酸小檗碱的检测。结果表明在中性环境中，室温下反应10 min后，体系荧光强度下降，且荧光强度在一定范围内与盐酸小檗碱的浓度成正比，线性范围为5.0×10-8～4.0×10-6mol·L-1，检出限为7.7×10-9mol·L-1，回收率为97.5%～105%。

参考文献：

[1] Liu D B，Chen W W，Wei J H.Analytical Chemistry，2012，84：4185.

[2] Zheng J，Zhou C，Yu M X.The Royal Society of Chemistry，2012，4：4073.

[3] XIA Q,LI C M.Chinese Traditional Patent Medicine(夏荃,李灿明.中成药),2008,30(7):1018.

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[5] LIU C J.Chinese Traditional Patent Medicine(刘存军.中成药),2007,29(12):1864.

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[9] XU Y Y,MAO S Z.Chinese Journal of Hospital Pharmacy(徐英瑜,毛书征.中国医院药学杂志),2001,21(12):27.

[10] Li S R.Chemical Physics Letters,2013,76:561.

[11] Wu X，He X X.The Royal Society of Chemistry,2010,2:2244.