聚L-半胱氨酸/还原氧化石墨烯/Nafion修饰玻碳电极对芦丁的电化学传感行为研究

韩海霞， 弓巧娟, 秦建芳， 王玉春， 姚陈忠

(1.山西师范大学化学与材料科学学院，山西临汾 041000;2.运城学院应用化学系，山西运城 044000)

石墨烯在电化学传感器的研究中备受关注[1 - 3]。芦丁属于黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗糖尿病、抗脂肪细胞与抗肿瘤活性等诸多药理和生理活性[4]，已用于治疗血管疾病、冠状动脉硬化、高血压以及关节炎等疾病[5]。目前检测芦丁的方法有高效液相色谱法[6]、分光光度法[7]、毛细管电泳[8]和电化学方法[2]等。电化学方法因检测速度快，灵敏度高以及易微型化等优势在芦丁药物分析研究中倍受青睐[9]。

芦丁在石墨烯复合材料上电化学行为的研究已有报道[10 - 11]，但采用氨基酸，特别是聚半胱氨酸(Poly-L-Cys) 修饰电极作为芦丁传感器尚未见报道。L-Cys分子中含有氨基、巯基和羟基等活性基团[12]，为芦丁在电极表面上的吸附提供了较丰富的活性位点[10]。本文使用聚Poly-L-Cys/rGO/Nafion修饰玻碳电极，研究了芦丁在其上的电化学行为，由此建立的芦丁电化学传感器与文献报道[9]相比，大大提高了检测灵敏度，为芦丁药物的检测及分析提供了一种新的方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI 660 型电化学工作站(上海辰华仪器公司)，实验采用三电极体系：Poly-L-Cys/rGO/GCE为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝为辅助电极；pHS-3C型pH 计(上海雷磁仪器公司)。

L-半胱氨酸(上海生工公司)，芦丁标准品(上海捷润公司)，石墨粉(东华石墨厂)，复方芦丁片(亚宝药业公司)，0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS)，其它试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。

1.2 Poly-L-Cys/rGO/GCE的制备

1.2.1玻碳电极预处理将玻碳电极(GCE)用0.05 μm Al2O3粉末在麂皮上抛光，然后用二次蒸馏水冲洗干净，红外灯烘干后，备用。

1.2.2rGO/GCE的制备采用改进的Hummers法合成氧化石墨烯(GO)[13]。用水合肼还原GO得到还原氧化石墨烯(rGO)。称取1 mg rGO超声分散于2 mL 0.2%的Nafion溶液中2 h，得0.5 mg/mL的rGO/Nafion溶液。移取5 μL rGO/Nafion溶液，滴涂于处理后的GCE表面，红外灯烘干，得rGO/Nafion/GCE。

1.2.3Poly-L-Cys/rGO/GCE的制备将rGO/Nafion/GCE浸入 pH=7.0的1.0×10-3mol/L的L-Cys溶液中，于电位-0.8～+2.2 V，在扫速100 mV/s下进行循环伏安(CV)扫描，取出电极用二次蒸馏水淋洗，于红外灯下烘干，得Poly-L-Cys/rGO/Nafion/GCE。用上述同样方法制备Poly-L-Cys/GCE。

2 结果与讨论

2.1 扫描电镜表征

从图1A可知，GO非单片层，表面粗糙且边缘呈皱褶状，表明GO未完全剥离。从图1B可见，rGO层状结构非常明显，且片层比较薄，说明rGO得到了很好的剥离，rGO层与层之间相互重叠，表明所制备的rGO是多层结构，且GO已被充分还原。从图1C可看到rGO表面拥有细小的颗粒，但分布并不均匀，这可能由于聚合过程中一部分L-Cys未能很好地吸附在rGO的表面，同时也表明L-Cys已成功聚合到rGO/Nafion/GCE表面。

图1 GO(A) rGO(B)和Poly-L-Cys/rGO/Nafion/GCE(C)的扫描电镜(SEM)图Fig.1 SEM of GO(A),rGO(B) and Poly-L-Cys/rGO/Nafion/GCE(C)

2.2 芦丁在不同电极上的电化学行为

采用CV法研究了芦丁在不同电极上，在含1.0×10-5mol/L芦丁的0.1 mol/L的 PBS(pH=2)中的电化学响应。从图2可知，芦丁在裸GCE上于0.58 V处的峰电流为2.9 μA(曲线a)，与之相比，Poly-L-Cys/GCE的峰电流值迅速增大至8.48 μA(曲线b)。这是因为芦丁中的羟基与L-Cys中的氨基作用形成氢键，使电子转移速度加快；当修饰电极为rGO/Nafion/GCE时，峰电流值增加到12.1 μA(曲线c)，应源于rGO优良的导电性能以及大的比表面积，提高了电极对芦丁的负载量；当用Poly-L-Cys/rGO/Nafion/GCE测定芦丁时，峰电流值达到17.5 μA，源于L-Cys的催化性能和rGO的优良性能，增加了反应活性位点，表现了L-Cys与rGO之间良好的协同作用。

2.3 L-Cys 聚合时间的优化

通过电聚合圈数来研究L-Cys 聚合时间对电极导电性能的影响。实验比较了聚合L-Cys圈数分别为5、10、15、20、35对电极性能的影响。结果表明，随扫描圈数的增加，峰电流(I)也随之增加，当扫至20圈时峰电流达到最大，之后随扫描圈数的增加，峰电流开始下降。说明随扫描圈数的增加，电极表面上的修饰膜的厚度也在增加，阻碍了电子的转移，峰电流降低，故后续实验采用扫描20圈制备修饰电极。

2.4 实验条件的优化

2.4.1溶液pH的影响考察了在不同pH的PBS中芦丁的CV行为。从图3中可看出，当pH=2时峰电流达到最大值，之后随溶液pH的增大，峰电流逐渐降低，峰电位负移，且pH与峰电位(E)呈良好线性关系，线性方程分别为：Epa(V)=-0.0605pH+0.7459(R2=0.9956)和Epc(V)=-0.0610pH+0.7004(R2=0.9967)，两方程中的斜率分别为60.5 mV/pH和61.0 mV/pH，这与能斯特值59 mV/pH很接近，说明参与电极反应的质子和电子的比例为1∶1[14]。因此选择pH=2的PBS为最佳电解质溶液。

2.4.2扫描速率的影响用CV法考察扫速v对芦丁峰电流的影响。结果发现，扫速在20～900 mV/s范围内，随扫速的增加，氧化还原峰电流也逐渐增加；且峰电位差逐渐增大，同时且发现峰电流与扫速v呈良好的线性关系，线性方程分别为：Ipa(μA)=-0.1284logv-6.1323(R2=0.9940)和Ipc(μA)=0.0943logv+3.3281(R2=0.9957)，表明该电极反应受吸附控制过程。

图2 芦丁在GCE(a)、Poly-L-Cys/GCE(b)、rGO/ Nafion/GCE(c)和Poly-L-Cys/rGO/Nafion/GCE(d)上的循环伏安(CV)曲线Fig.2 CV curves of rutin at GCE(a),Poly-L-Cys/GCE(b),rGO/Nafion/GCE(c) and Poly-L-Cys/rGO/Nafion/GCE(d)

图3 Poly-L-Cys/rGO/Nafion/GCE在含1.0×10-5 mol/L芦丁的不同pH的PBS中的循环伏安(CV)图Fig.3 CVs of 1.0×10-5 mol/L rutin at Poly-L-Cys/rGO/Nafion/GCE in PBS buffers with different pH valuespH(a-g):2,3,4,5,6,7,8.

2.5 芦丁的检测

图4 不同浓度芦丁在Poly-L-Cys/rGO/Nafion/GCE上的示差脉冲伏安(DPV)图Fig.4 DPV of different concentrations of rutin at Poly-L-Cys/rGO/Nafion/GCEa→j:2.0×10-8～1.0×10-5 mol/L.

在优化条件下，使用示差脉冲伏安法(DPV)考察了该传感器对芦丁的响应能力。由图4可见，随芦丁浓度的增大，峰电流随之线性增加，且浓度在2.0×10-8～1.0×10-5mol/L范围内与峰电流呈良好线性关系，线性方程为：I(μA)=-4.1181c+3.0502(R2=0.9970)，检出限(S/N=3)为1.0×10-8mol/L。结果表明，该传感器拥有较宽的检测范围和较低的检出限，灵敏度较高。这源于L-Cys 和rGO之间的协同作用改进了电极表面的性能。

2.6 稳定性、重复性和干扰实验

2.7 样品分析

取2片复方芦丁片(20 mg/片)，放入研钵研磨成粉末，用无水乙醇溶解后过滤，滤液定容至100 mL，得浓度为6.5×10-4mol/L储备液。分别移取100 μL储备液于3个10 mL离心管中，然后分别加入1、2、3 mL 1.0×10-5mol/L芦丁标准液，用pH=2的PBS定容至刻度。使用标准加入法进行DPV检测，结果见表1。从表可得，该传感器的回收率在97%～103%之间。

表1 芦丁样品的含量测定(n=5)

3 结论

制备了修饰电极Poly-L-Cys/rGO/Nafion/GCE。该传感器因rGO大的比表面、较快的电子转移速率和L-Cys较高的电催化活性，从而使其对芦丁的吸附以及电催化氧化活性提高。在最优条件下，该传感器对芦丁有宽的线性范围和较低的检测限，可用于真实样品中芦丁简便有效测定。

参考文献：

[2] Roushani M,Valipour A.Sensors and Actuators B,2016,222:1103.

[3] Zhang K X,Xu J K,Zhu X F,Lu L M,Duan X M,Hu D F,Dong L Q,Sun H,Gao Y S,Wu Y.Journal of Electroanalytical Chemistry,2015,739:66.

[4] Yang L T,Yang J,Xu B J,Zhao F Q,Zeng B Z.Talanta,2016,161:413.

[5] Liu Z G,Xue Q,Guo Y J.Biosens Biolectro,2017,89:444.

[6] Attia T Z.Spectrochimica Acta Part A:Molecular and Biomolecular Spectroscopy,2016,169:82.

[7] Yang D,Li H Y,Li Z Y,Hao Z B,Li J P.Luminescence,2010,25:436.

[8] Li C H,Chen A J,Chen X F,Chen X G,Hu Z D.J Pharma Biomed Anal,2005,39:125.

[9] XIE D,LONG L P,LIU R,ZHONG T S,LI Y,YANG Q T.Journal of Analytical Science(谢丹，龙立平，刘蓉，钟桐生，李媛，唐桥亭.分析科学学报)，2017,33(4):545.

[10] Sun X M,Ji Z,Xiong M X,Chen W.Journal of The Electrochemical Society,2017,164(4):107.

[11] Jiang Z M,Li G Y,Zhang M X.Sensors and Actuators B:Chemical,2016,228:59.

[12] Ferrazn B R L,Leite F R F,Malagutti A R.Talanta,2016,154:197.

[13] Hummers Jr W S,Offeman R E.J Am Chem Soc,1958,80(6):1339.

[14] Li S M,Yang B B,Wang J,Bin D,Wang C Q,Zhang K,Du Y K.Anal Methods,2016,8:5435.