小麦QTL富集区 QC-4BS重要农艺性状基因的精细定位及 Rht1基因的效应分析

丁梦云，刘天相，孙宇慧，柴乖强，高 欣，王 军，王中华，李春莲

(西北农林科技大学农学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌 712100)

小麦是世界上最重要的粮食作物之一，培育高产、优质、多抗、广适的小麦品种是小麦育种工作的总体目标。小麦的大部分农艺性状，如产量性状、品质性状、适应性状及株型性状等为多基因控制的数量性状，受环境影响较大。近年来，随着分子标记技术的快速发展和数量性状位点(quantitative trait locus， QTL)定位方法的不断改进，使得利用分子标记技术和QTL分析方法定位数量性状基因、筛选与性状紧密连锁的分子标记用于辅助育种成为可能。越来越多的控制小麦重要农艺性状的QTL被发现和定位，同时一些与QTL紧密连锁的分子标记不断地被开发应用于分子标记辅助选择育种[1-3]，从而大大地加快了育种进程，提高了育种效率。研究表明，在大多数作物中，与农艺性状相关的QTL在染色体上往往成簇分布，即控制不同性状的QTL存在于同一染色体的某一区段，从而形成QTL富集区[4-6]。QTL富集区的形成原因主要有两种：一是控制多个性状的几个基因彼此紧密连锁形成基因簇；二是单一基因直接或间接影响多个性状，即一因多效现象[7-9]。

在前期研究中，本课题组在1BS、2DS、4BS、5AL、6AL和7AL等染色体上发现了多个与小麦重要农艺性状相关的QTL富集区，其中位于4BS的Xwmc48至IWA4662标记区间是小麦重要农艺性状的一个主要的QTL富集区，区间长度为14.7 cM，将其定名为 QC-4BS。与穗粒数(KNPS)、千粒重(TKW)、株高(PH)、蛋白质含量(GPC)、容重(TW)、单粒重和粒宽相关的7个主效QTL位于 QC-4BS区间，解释的表型变异分别可达14.5%、14.4%、36.0%、22.0%、29.5%、27.6%和13.4%，其中与PH、KNPS、GPC及TW相关的QTL在多个环境中均可检测到，且已确定控制株高的QTL为 Rht1基因[10-12]。因此探明 QC-4BS染色体功能区段的遗传效应，挖掘其功能基因，揭示其传递机制及基因间的互作效应对于小麦产量及品质性状的选育及遗传改良具有重要的意义。本研究拟通过对 QC-4BS的精细定位，及分析 Rht1基因对小麦PH、KNPS、GPC及TW等性状的遗传效应，筛选与这些性状紧密连锁的分子标记，为小麦优良基因的挖掘及小麦染色体功能区段形成机制的研究奠定基础，同时为小麦分子标记辅助选择育种及多性状聚合育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为普通小麦(TriticumaestivumL.)宁7840与Clark杂交获得的127个F12代重组自交系(Recombinant inbred line，RIL),由美国堪萨斯州立大学Guihua Bai教授惠赠。宁7840为江苏省农业科学院育成的硬红粒小麦品种，每穗粒数30～35粒，千粒重35 g左右，株高偏高，对小麦锈病、白粉病及赤霉病均具有抗性，是多抗性育种的重要基础材料[13]；Clark为美国普渡大学育成的软粒冬小麦品种，长穗、大粒，具有较好的产量潜力[14]。亲本及RIL株系的PH、KNPS、GPC及TW性状鉴定方法及表型值参见Li等[10-12]研究。

1.2 遗传连锁图谱的构建

采用9K InfiniumTMiSelect SNP基因芯片及亲本间有差异的SSR标记对RIL群体进行分析，共获得了2 404个SNP标记和366个SSR标记。采用QTL IciMapping 4.0软件构建遗传连锁图谱，连锁群的LOD阈值设为6.0，利用Kosambi作图函数将重组率转换为遗传距离(cM)，根据SSR 共识图谱[15]及GrainGenes 2.0网站上公布的小麦SNP遗传图谱进行连锁群染色体定位。

1.3 QTL分析

基于完备复合区间作图法(ICIM-ADD)，采用QTL IciMapping 4.0软件对PH、KNPS、GPC及TW等性状进行QTL分析。在扫描步长为1.0 cM，α=0.001的水平上，利用置换检验法(Permutation test)做1 000 次重复，将第一类错误概率(假阳性)限制在5%，估算基因组范围内的LOD阈值，并以此确定QTL在染色体上的位置及数目。

2 结果与分析

2.1 QC-4BS区间的QTL分析

构建的遗传连锁图谱中共有2 709个标记，包括2 403个SNP标记和306个SSR标记定位到了45个连锁群中，覆盖了小麦21个遗传连锁群。图谱总遗传长度为3 885.1 cM，标记密度为1.43 cM。利用该图谱对PH、KNPS、GPC及TW进行了QTL分析，其中 QC-4BS位于小麦4BS染色体的Xwmc48至IWA4662标记区间(图1)。 QC-4BS中控制PH的QTL位于IWA1846至IWA4662标记区间，区间长度为11.9 cM，LOD峰值接近IWA482，解释的表型变异为15.5%～31.4%；控制KNPS的QTL主要位于 QC-4BS的Xwmc48至IWA482标记区间，区间长度为8.7 cM，LOD峰值接近IWA6850，解释的表型变异为10.4%～15.4%；控制GPC的QTL位于 QC-4BS的Xgwm368至IWA4662标记区间，区间长度为17.5 cM，LOD峰值接近IWA6850，解释的表型变异为7.5%～18.6%；控制TW的QTL位于 QC-4BS的IWA482至IWA4662标记区间，区间长度为11.0 cM，LOD峰值接近IWA482，解释的表型变异为6.7%～20.4%(表1)。

图1 QC-4BS富集区的QTL

2.2 QC-4BS富集区基因位点的精细定位

由QTL分析结果及其峰值所在位置可知， QC-4BS基本位于SNP标记IWA1846至IWA4662区间内，将该标记区间(长度为11.9 cM)对应在660K遗传图谱中(未发表)，并利用已公布的小麦基因组数据(IWGSC Reference Sequence v1.0，https：//wheat-urgi.versailles.inra.fr)对该区间的基因进行了精细定位。结果(图2)表明，该区间对应的物理距离约为15.17 Mb， Rht1基因(控制PH的QTL位点)距离IWA1846约7.16 Mb；GPC和KNPS位点接近IWA482标记；TW位点接近 Rht1基因。

2.3 Rht1基因对小麦重要农艺性状的效应

Rht1基因对PH、KNPS、TKW、GPC及TW等性状的效应分析结果(表2)表明，该基因具有降低PH的效应，在检测的3个环境中， Rht1降低PH的效应均达到了极显著水平，其效应值为9.0%～9.8%； Rht1对产量因子KNPS和TKW的效应相反， Rht1显著增加KNPS，其效应值为3.4%～10.7%，在检测的3个环境中均达到了显著或极显著水平，而 Rht1对TKW为负效应，其降低TKW的效应在两个环境具有显著差异； Rht1对品质性状GPC和TW均为显著负效应，其效应值分别为3.3%～4.4%和0.8%～3.1%。

表1 QC-4BS富集区的QTL分析Table 1 QTL analysis of QC-4BS cluster

ST01、ST02、ST03、LA02、AL02中ST、LA和AL分别表示美国Oklahoma州的Stillwater(ST)、Lahoma(LA)和Altus(AL)，数字01、02和03代表不同年份。

The ST,LA and AL represent three Oklahoma locations,Stillwater(ST),Lahoma(LA) and Altus(AL) in USA,respectively; and 01,02,and 03 represent three different years,respectively.

图2 QC-4BS富集区重要农艺性状基因的精细定位

性状Trait株高PH/cmST01ST02ST03穗粒数KNPSST01ST02ST03千粒重TKW/gST01ST02ST03蛋白质含量GPC/%ST01ST02ST03容重TW/(g·L-1)ST01ST02ST03表型值(Rht1+)Phenotypevalue(Rht1+)63.974.874.437.834.439.129.921.928.512.712.813.8537493527表型值(Rht1-)Phenotypevalue(Rht1-)69.682.181.136.631.136.031.024.330.213.113.314.4541509537效应Effect/%-8.2**-8.9**-8.3**3.4*10.7**8.5**-3.7-10.1**-5.5*-3.3**-3.9**-4.4**-0.8*-3.1**-1.8**

**：P<0.01；*：P<0.05.

3 讨 论

本研究发现 QC-4BS位于小麦4BS染色体上的Xwmc48至IWA4662标记区间，在该区间前人也曾定位到了与小麦产量、株高、抽穗期、粒重、收获指数、成穗数、穗粒数及成熟期等性状相关的QTL[16-21]，表明 QC-4BS的确是一个小麦重要农艺性状的QTL富集区。本研究根据小麦660K连锁图谱及小麦基因组数据对 QC-4BS区间的基因进行了精细定位，将 QC-4BS定位在WA1846至IWA4662标记区间，其对应的物理距离为15.17 Mb。已知 QC-4BS中控制株高的QTL为 Rht1基因[20]，距离IWA1846标记约7.16 Mb，根据GPC和KNPS的峰值位点标记 IWA6850/IWA1846及TW的峰值位点标记 IWA482，将控制KNPS、GPC及TW的位点定位在 Rht1附近。目前，在 QC-4BS富集区还未定名任何与产量及品质性状相关的基因，而本研究在该区间定位的与KNPS、GPC及TW相关的QTL在多个环境中均被检测到，且具有相对较大的遗传效应，表明该区间存在与产量及品质性状相关的基因。相关性分析结果表明，不同环境中的PH、 KNPS、GPC及TW之间均存在显著相关性，具体表现为PH与KNPS为负相关，而与GPC和TW为正相关；KNPS与GPC和TW之间为负相关，而且IWA482、IWA1846、IWA6850、IWA4662等标记与这些性状紧密连锁，表明这些性状之间可能存在一因多效或基因互作效应。进一步分析发现，在 QC-4BS中增加PH、GPC和TW的等位基因及减少KNPS的等位基因来自亲本宁7840。单倍型分析显示RIL群体中与宁7840基因型一致的株系平均PH、GPC及TW均显著高于其他株系，而KNPS低于其他株系，即高株、高蛋白质含量、高容重及低穗粒数为连锁性状，因此在育种中宜根据育种目的进行 QC-4BS富集区优异基因的聚合及优良性状的选择。此外，IWA482、IWA1846、IWA6850、IWA4662等标记可以作为这些性状的选择标记。

本研究对 Rht1基因对小麦PH、KNPS、TKW、GPC及TW的效应进行了分析，结果显示 Rht1基因具有降低株高的作用，其降秆效应为8.2%～8.9%，比其他研究中的 Rht1的降秆强度(20%～25%)相对较弱[22-25]，这可能是因为本研究采用的研究群体较为特殊，在该群体中还检测到了另外一个矮秆基因 Rht12(QPh.hwwgr-5AL)及其他矮秆位点[22]，这些基因位点间的互作导致了该群体株高存在复杂的变异。前人研究表明，矮秆基因对小麦某些农艺性状是有影响的，尤其是产量和品质性状[25-26]。 Rht1及 Rht2为赤霉酸不敏感基因，研究表明这类矮秆基因在选育品种中分布较广，除了降低株高，防倒伏外，还具有增加小穗结实率、降低粒重和蛋白质含量的效应[27-29]。Mccartney等[30]对春小麦农艺性状QTL研究发现， Rht1位点往往与产量构成因子的QTL热点区域重合。本研究中采用RIL家系同样发现 Rht1具有显著增加小麦穗粒数、降低蛋白质含量及千粒重的效应，这与前人的研究结果[25-28]是一致的。而且， Rht1基因与KNPS、GPC及TW位点紧密连锁，这些研究结果进一步表明，在小麦育种选择中注重株高选择的同时要兼顾产量性状及品质性状的选择。

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