白细胞介素17A对右侧星状神经节功能和活性的影响

袁申戌 黄兵 余锂镭 王梦龙 周丽平 江洪

近年来，有研究表明白细胞介素17A(IL-17A)与多种心血管疾病相关，如动脉粥样硬化、高血压、心肌梗死等[1]。近期研究发现IL-17A干预显著恶化心肌梗死后缺血再灌注损伤以及远期的心室重构[2-4]。既往研究表明IL-17A可以诱导炎症，而炎症可以激活交感神经[5-6]。同时右侧星状神经节(RSG)的激活是不适当窦性心动过速(IST)的重要环节[7]。所以笔者推测IL-17A可能可通过激活RSG在IST发生发展中发挥作用。笔者通过测定RSG功能、神经活性、早期原癌基因(c-fos)和神经生长因子(NGF)表达水平来评估IL-17A对于RSG的功能和活性的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及准备 本研究由武汉大学动物实验伦理委员会审核并批准，研究严格遵守由美国国立卫生研究院出版的实验动物保健和使用指南( NIH出版No.85-23，修订于1996)。体重18～20 kg的健康成年杂种犬16只(由武汉大学人民医院实验动物中心提供)，随机分为实验组 (n=8)和对照组 (n=8)。经3%戊巴比妥钠30 mg /kg静脉麻醉，每小时补充2 mg /kg 苯巴比妥钠以维持麻醉状态，气管插管接动物呼吸机(型号MAO01746，哈佛仪器，霍里斯顿，美国)给予持续正压通气。在犬的下方放置一加热垫以保持其体温在36.5℃±1.5℃。分别穿刺左侧股动脉、股静脉并置入鞘管，股动脉通道用于监测动脉血压，股静脉通道用于持续生理盐水补液。将电极片固定于犬四肢表皮，以Ⅱ导联作为监护导联，连接LEAD7000多导电生理仪(锦江电子，成都，四川)持续检测体表心电图和动脉血压。

1.2RSG内给药 右侧第3肋间打开胸腔，暴露RSG所在区域，用电极导管高频电刺激(HFS：频率20 Hz，脉宽0.1 ms)时能引起心率上升最高的位点即为RSG。IL-17A试剂购自Sigma公司，利用生理盐水将其配置成100 μg/ml置于-20℃冰箱保存，实验前用生理盐水将其稀释至25 μg/ml。实验组将1 ml IL-17A在直视状态下均匀分4个注射点缓慢注射到RSG内，使IL-17A充分进入RSG。对照组注射等体积的生理盐水。

1.3RSG功能测定 根据我们既往研究[7]，将一根直径0.1 mm 的银丝插入RSG，连接刺激仪，以20 V的高频刺激(HFS：频率20 Hz，脉宽0.1 ms)寻找到刺激RSG时心率变化最大的位点，在该位点处固定银金属丝。分别在基础状态以及药品注射后30 min以10、20、30、40、50V的高频电刺激RSG测定HFS引起的最大心率变化百分比，以最大心率变化百分比代表RSG功能。

1.4RSG神经活性测定 参照团队既往研究[8]，将两个钨丝微电极用微型固定器并列固定，调整微电极尖端距离2～3 mm，微电极尖端插入RSG记录神经活性。电极连接PowerLab神经活性记录仪(AD Instruments, 澳大利亚)，采样频率设置为300～1 000 Hz，通过一个放大器(DP-304, 华纳仪器, 美国)进行放大。神经活性信号定义为高于噪音振幅3倍的记录信号，寻找信噪比稳定且大于3倍的位点，固定微电极并长时间记录神经信号。分别在基础状态和药品注射后30 min记录RSG神经活性，采用Labchart分析软件分析神经活性频率和振幅。

1.5RSG中c-fos和NGF测定 实验结束后，在直视下留取RSG组织，用0.9%生理盐水冲洗后迅速置于-80℃冰箱中备用。取适量RSG组织以二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度，取50 μg蛋白上样，采用10%SDS-PAGE胶电泳，目的蛋白充分分离后200 mA×50 min半干转至PVDF膜。含5%脱脂奶粉的TBST封闭液浸泡PVDF膜，室温摇床封闭1 h，封闭后用TBST洗膜5 min，共3次。将PVDF膜置于一抗(NGF、c-fos：Abcam，剑桥，英国)中4°C孵育过夜。添加相应种属的二抗室温孵育1 h，TBST洗冲分洗涤PVDF膜，用Bio-RAD凝胶成像系统检测目的条带，以GAPDH为内参分析c-ofs和NGF表达水平。

1.6统计学分析 所有计量资料均采用均数±标准差表示，所有分析采用SPSS 18.0 统计分析软件( SPSS Inc．芝加哥，美国) 进行。组间比较采用两样本均数的t检验，组内比较采用配对t检验。以P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1两组RSG功能的比较 实验组干预30 min后心率加快(P<0.05)，而对照组心率无明显升高(P>0.05)。与对照组干预30 min后比较，实验组心率加快作用显著高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 两组不同刺激电压下基础状态和干预30 min后的最大心率变化百分比

注：与同组基础状态比较，*P<0.05；与对照组相应时间比较，#P<0.05

2.2两组RSG神经活性的比较 实验组干预后RSG神经活性频率和幅度显著升高(P<0.05)；而对照组中无明显改变(P>0.05)。且干预30min后，对照组RSG神经活性放电频率和振幅显著低于实验组(P<0.05)。见图1、表2。

2.3两组RSG中c-fos和NRG的比较 两组干预前后具有代表性的RSG中c-fos和NGF电泳图见图2。与对照组比较，实验组干预后RSG中c-fos和NGF的表达水平显著升高(P均<0.05)。见表3。

图1 RSG神经活性变化

组别放电频率/(次/分)放电振幅/mV对照组 基础状态50±80．04±0．01(n=8) 30min后58±100．05±0．01实验组 基础状态48±100．04±0．01(n=8) 30min后148±22∗#0．09±0．01∗#

注：与同组基础状态比较，*P<0.05；与对照组相应时间比较，#P<0.05

图2 两组干预后RSG中c-fos和NGF电泳图

组别nc⁃fos相对蛋白水平NGF相对蛋白水平对照组80．55±0．090．11±0．03实验组80．58±0．08#0．16±0．04#

注：与对照组比较，#P<0.05

3 讨论

本研究主要发现向RSG中注射IL-17A可显著增强RSG功能和活性，增加神经相关蛋白表达水平。

星状神经节由脊髓发出的颈下神经节与第一胸交感神经融合而成，是交感神经系统支配心脏的重要节点，其心下神经支加入心丛，调节心脏活动。研究表明，左、右星状神经节对于心脏的调控具有偏侧性，其中RSG主要调控窦房结的电活动，刺激RSG可以引起窦性心率加快，阻滞RSG则可以减慢心率，延长RR间期，对血压几乎没有影响[9-11]。本研究结果中，HFS刺激RSG可显著提升心率，同时IL-17A可显著提高HFS刺激RSG所导致的最大心率变化百分比，增强RSG的功能。

IL-17A是IL-17家族成员中被报道最多的一个细胞因子。IL-17A参与到固有免疫与特异性免疫之中，诱导炎症因子以及趋化因子的表达，从而招募更多的免疫细胞到达炎症部位加剧机体的炎症反应[5, 12]。之前大量研究表明炎症可以调控交感神经活性。向大鼠穹隆下器官注射促炎因子TNF-α可以显著提高腰椎和内脏交感神经活性并提升平均动脉压[13]。笔者之前的研究发现直接向左侧星状神经节注射IL-1β可以直接激活左侧星状神经节，并增加心肌梗死后室性心律失常的发生[6]。反之，利用非特异性的细胞因子合成抑制剂或者特异性的TNF-α抑制剂阻断炎症通路均可抑制交感神经活性[14]。同时，炎症反应中大量聚集的炎症细胞如成肌纤维细胞和巨噬细胞可以分泌NGF[15]。NGF是交感神经生长、分化的生物学标志，被认为是启动交感神经病态生长的神经生长因子[16]。c-fos蛋白在神经元活动时表达活跃，被广泛用于神经快速激活的标志物[17]。这些研究表明炎症反应可以增加交感神经活性。本研究在体神经活性记录提示IL-17A增强RSG神经活性；同时增加c-fos和NGF表达，证实IL-17A可激活RSG。

笔者及其他学者的研究均证实抑制RSG活性可以显著降低IST的发生[7,18]。IL-17A可能对于IST发生起到促进作用，因此通过靶向IL-17A的治疗可能成为治疗药物难治性IST的新策略。

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