抑制PI3K/Akt信号通路对胶质瘤侵袭性及增殖力的影响

张振国，贾丽燕，杨廷舰，袁义美*，刘 伟*

（1．潍坊医学院临床医学院，山东 潍坊 261031；2．潍坊医学院附属医院神经外科，山东 潍坊 261031）

胶质瘤是最多见的一类脑肿瘤，呈侵袭性生长，病情进展常常累及周围脑组织，所以单纯依靠手术切除无法治愈，5年存活率约为25%～35%[1,2]，同时胶质瘤细胞抵抗射线辐射能力强，所以放射疗法对于患者的预后意义不大[3]。随着在分子生物学领域的研究深入，靶向治疗胶质瘤具有重大意义，能够对肿瘤进行选择性杀伤[4]。多种因子共同参与致使胶质瘤具有生长侵袭性，其中PI3K/Akt通路激活具有关键性作用[5,6]，其可以参与细胞下游信号的激活，调节细胞的转移、增殖和代谢等[7]，因此通过研发特异性分子抑制剂对治疗胶质瘤意义深远。本实验以LY294002抑制PI3K/Akt通路活性，探究胶质瘤侵袭性及增殖力的变化，现对实验相关信息报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

（1）解冻：购自上海中科院生物学细胞库的胶质瘤HS683细胞1瓶（1×106cells/瓶），在37℃的温水中快速将其溶解；（2）脱壁：适量预温（37℃）的PBS缓冲液润洗细胞3次，1 min/次；（3）消化：加入适量0.25%胰蛋白酶溶液，在二氧化碳培养箱（37℃、5% CO2）内消化2分钟；（4）终止消化：倒置显微镜下观察可见细胞形态收缩变圆并脱落至瓶底，加入6 ml DMEM培养基（含10%胎牛血清）立即终止消化；（5）细胞悬液：无菌吸管由下向上反复轻轻吹打，使其分散离团制成单个细胞悬液；（6）转移细胞至EP管中调整密度为104/200 μl，并加入0.4%的台盼蓝染色。

1.2 方法

1.2.1 MTT法

（1）微量移液器接种200 μl细胞悬液至96孔细胞板，培养箱（37℃、5% CO2）中孵育24小时；（2）把EP管做好标记并加入适量的无血清培养基，从高到低稀释药物浓度，分别向管中加入等量浓度为10 umol/L、20 umol/L、40 umol/L的LY294002，以及浓度为2.5 ug/ml的顺铂，充分混匀，空白对照组不进行药物处理；（3）以每种药物、不同浓度重复3个复孔，分别向细胞板孔中加入200 μl无血清培养基，继续培养6小时；（4）细胞孔内加入20 ml浓度为5 mg/ml的MTT溶液（避光），作用4小时，弃去上清液并加入150 μl的DMSO溶液，蓝色结晶溶解后使用酶标仪进行检测。

1.2.2 Transwell侵袭实验

（1）将冰存的Matrigel置于-4℃的冰上过夜，用冰预冷的无血清培养基按照1:6稀释Matrigel至浓度为300 ul/ml，取100 ul稀释的Matrigel加入上室，均匀涂抹在孔径为8 um的碳酸酯膜表面，室温放置3小时，使其聚合成凝胶；（2）向上室加入100 ul细胞悬液，并分别加入100 μl含有不同药物、不同浓度的培养基，下室加入400 ul含趋化因子的无血清培养基；（3）放入培养箱中培养24小时，无菌棉签拭去上室碳酸酯膜表面残存的细胞，PBS缓冲液润洗2次，1min/次；（4）3%甲醛溶液固定10 min，台盼蓝染色3分钟，低倍显微镜下进行观察，计数随机5个视野内的细胞平均数。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 两组侵袭细胞数比较

与空白对照组比较，DDP对照组胶质瘤细胞的侵袭性减弱（P＞0.05），差异无统计学意义（见表1）。

表1 两组侵袭细胞数比较

2.3 三组侵袭细胞数比较

与空白对照组、DDP对照组比较，实验组（LY294002 10 umol/L）胶质瘤细胞的侵袭性明显减弱，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 对照组与实验组侵袭细胞数比较

2.4 三组侵袭细胞数比较

与实验组（LY294002 10 umol/L）比较，实验组（LY294002 20 umol/L、40 umol/L）胶质瘤细胞的侵袭性减弱，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 实验组与实验组侵袭细胞数比较

2.5 两组细胞相对增殖率比

与空白对照组、DDP对照组比较，实验组（LY294002 10 μmol/L）细胞的相对增殖率明显降低，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L的LY294002可以使细胞相对增殖率从86.4%降至58.3%、37.9%、20.0%。见图1。

图1 对照组与实验组细胞相对增殖率比较

3 讨 论

胶质瘤是恶性程度很高的原发性脑肿瘤，在整个中枢神经系统肿瘤中发病率约占36%～61%[8]。同时肿瘤的临床表现形式也是多种多样，其中以占位效应最为突出，系于不断增大的瘤体以及水肿程度加剧的周围脑组织对正常脑组织的压迫所致，颅内压增高一般会有三种常见的症状，诸如：头痛（最多见）、呕吐（喷射性）、视物不清等[9]。除此之外，还有部分恶性程度很高的胶质瘤往往发生发展迅速，可在短时间内压迫正常脑组织并使之移位，有发生脑疝的风险[10]。尽管目前针对胶质瘤治疗的手术及化疗药物都不断得到改进，但疗效一般，其中位生存期只有1年左右[11]。患者接受常规手术治疗后容易再次复发的一个重要原因就是胶质瘤不断侵袭转染周围正常脑组织[12]，同时射线只能不同程度的杀死恶变细胞，所以疗效不理想。

随着在分子生物学领域不断取得新的突破性进展，已有研究表明，激活的PI3K/Akt信号通路具有很强的刺激肿瘤生长侵袭的作用。胶质瘤发生演变的早期阶段，经历的主要分子事件即为表皮因子生长受体（EGFR）由于受到多种因素诱导发生的基因突变以及蛋白的过度表达[13]。EGFR与其相应的胞内或膜上配体结合可以激活自身，或由于体内EGFR受环境影响发生基因突变从而导致其处于持续的活化不衰减状态，这样会把酪氨酸不断活化使之在细胞内持续表现为磷酸化形式[14]。EGFR可以通过多种方式调控细胞的生长代谢途径，导致肿瘤细胞在体内过度增殖[15]，最关键的途径就是通过PI3K增加此信号通路的活性。PI3K作为细胞膜上的第二信使，可以调节多种活性蛋白的表达，发挥调节细胞生长、迁移、代谢等的生理学作用，这极大地提高了胶质瘤的侵袭性及增殖力[16]，因此通过特异性分子抑制剂减弱PI3K/Akt信号通路能够为广大胶质瘤患者带来一丝曙光，为临床医师提供更有效的诊疗方案[17]。

已有研究证实，肺癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌等恶性肿瘤患者通过应用LY294002可以明显提高化疗效果，对改善患者预后有很大的帮助，但在胶质瘤治疗效果方面的报道仍很罕见，我们的数据表明抑制PI3K/Akt通路在降低肿瘤侵袭能力方面有着积极的作用；有研究发现，化疗药物顺铂联合LY294002应用组胶质瘤细胞的迁移及增殖力较单纯使用顺铂组减弱，差异有统计学意义，抑制浓度俞大抑制效应愈显著，但结果尚差异无统计学意义；李洋等人研究发现与对照组、DMSO组相比，经过LY294002处理的胶质瘤细胞增殖力明显降低（10 μmol/L LY294002组相对存活率为55%，20 μmol/L组为30%），实验同时表明，LY294002组胶质瘤的侵袭能力明显降低（52±4）%，差异显著。该实验同样发现，DDP组相较于空白组细胞的生长侵袭性也有不同程度的减弱，但结果差异尚无统计学意义，与空白对照组和DDP组相比，实验组（LY294002 10 μmol/L）细胞的生长侵袭性受到非常大程度抑制，差异有统计学意义。本实验同之前报道过的相关实验相比优点在于，研究同样也表明，随着抑制剂浓度的增大（10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L LY294002)，细胞的侵袭性以及增殖力会更加减弱，但是，抑制剂的不同浓度对胶质瘤的抑制效应，差异无统计学意义，仍需进行下一步探讨研究。

随着在医学分子生物学领域不断取得新的进展，未来科研的重点应放在加快针对此信号通路抑制药物的研发，这些分子靶向性药物有望在胶质瘤的治疗中发挥更有效的作用，以期取得令人更满意的临床效果。

[1]刘志国,李连陵,王 通.脑胶质瘤细胞、组织中PGAM1 mRNA、蛋白的表达变化及意义[J].山东医药,2013,53(2):56-58.

[2]0hgaki H,Kleihues P.Epidemiology and etiology of gliomas[J].Acta Neuorpathol,2005,109(1):93-108.

[3]曾纪权. HER-2基因和基质金属蛋白酶-9在大肠癌中的表达和临床意义[J].实用癌症杂志,2013,21(3):254-257.

[4]Butowski NA,Sneed PK,Chang SM.Diagnosis and treatment of recurrent high-grade astrocytoma[J].J Clin Oncol,2006,24(8):1273-1280.

[5]Zhang JG,Wang JJ,Zhao F,et al.MicroRNA-21(miR-21) represses tumor suppressor PTEN and promotes growth and invasion in nonsmall cell lung cancer (NSCLC)[J].Clin Clim Acta,2010,411(11-12):846-852.

[6]Jiang BH,Liu LZ.PI3K/PTEN signaling in angiogenesis and tumorigenesis[J].Adv Cancer Res,2009,102(1):19-65.

[7]Cully M, You H,Levine AJ,et al.Beyond PTEN mutations:the PI3K pathway as an integrator of multiple inputs during tumorigenesis[J].Nat Rev Cancer,2006,3:184-192.

[8]王忠诚.神经外科学[M].第二版.武汉;湖北科学技术出版社,2005:512-516.

[9]Das B,Yeger H,Tsuchida R,et al. A hypoxia-driven vascular endothelial growth factor/Flt1 autocrine loop interacts with hypoxiainducible factor-1 alpha through mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase 1/2 pathway in neuroblastoma[J].Cancer Res,2015,65(16):7267-7275.

[10]韦鹏翔.中国中西医实用神经外科学[M].2015,北京:中国医药科技出版社,2015:501-520.

[11]Habberstad AH, Lind-Landstrom T,Sundstorm S,et al.Primary human glioblastomas-prognostic value of clinical and histopathological parameters[J].Clin Neuropathol,2012,31(5):361-368.

[12]Cheng YK,Beroukhim R,Levine RL,et al.A mathematical methodology for determining the temporal order of pathway alterations arising during glioma- genesis[J].Plos Comput Biol,2012,8(1):e1002.

[13]Brandes AA,Franceschi E,Tosoni A,et al.Epidermal growth factor receptor inhibitors in neuro-oncoloy:hopes and disappointments[J].Clin Cancer Res,2008,14(4):957-960.

[14]Micallef J,Taccone M,Mukherjee J,et al.Epidermal growth factor receptor variant III-induced glioma invasion is mediated through myristoylated alanine-rich protein kinase C substrate overexpression[J].Cancer Res 2009,69(19):7548-7556.

[15]Hatanpaa KJ,Burma S,Zhao D,et al.Epidermal growth factor receptor in glioma:signal transduction,neuropathology,imaging,a nd radioresistance[J].Neoplasis,2010,12(9):675-684.

[16]Chakravarti A,Zhai G, Suzuki Y, et al.The prognostic significance of phosphatidylinositol 3-kinase pathway activation in human gliomas[J].J Clin Oncol,2004,22(10):1926-1933.

[17]董 伦,蒲佩玉,王 虎,等.EGFR反义RNA与p53基因联合转导抑制胶质瘤细胞增殖的体外实验研究[J].中华神经外科杂志,2007,23:678-681.