初发急性白血病患者骨髓乳腺癌耐药蛋白基因表达及其与预后关系的研究

刘劲，李薇，段华新，罗科玲，周煦

（湖南省人民医院 1.肿瘤科，2.血液科，3.重症医学科，湖南 长沙 410005）

急性白血病（acute leukemia，AL）是血液系统 造血干细胞的一种恶性克隆增殖性疾病，其起病急，恶性程度高，严重威胁人类生命健康。异常造血细胞的增殖分化异常导致正常血细胞减少，临床主要表现为贫血、出血和感染等征象[1]。急性白血病的发生受多基因异常调控的疾病，许多基因包括KIT、FLT3、NPM1和CEBPA均在急性白血病中表达失调，且与疾病的疗效及预后判断中具有一定的价值[2]。急性白血病的化疗耐药是治疗过程中遇到的一大难题，乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）基因编码重要的膜转运蛋白，在白血病多药耐药方面发挥重要的作用[3-4]，影响患者的疗效和预后。目前尚无骨髓BCRP基因表达与急性白血病患者预后关系的研究报道。本研究拟通过实时定量PCR检测初发急性白血病患者骨髓BCRP基因表达，随访患者预后，分析骨髓BCRP基因表达与急性白血病预后的关联，为治疗方案的制定和优化提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2014年1月-2014年12月入住我院血液内科的急性白血病患者67例。其中，男性36例，女性31例；年龄19～68岁，平均39.0岁，中位年龄40岁。入选患者均符合中华医学会血液学分会制定的初发急性白血病的诊断标准[5]，并通过细胞形态学、组织化学染色及免疫学分型，其中AML 42例，ALL 25例。同时还选择50例健康志愿者作为对照组。男性30例，女性20例；年龄20～65岁，平均36.2岁。白血病患者与健康志愿者在性别和年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 标本收集及骨BCRP基因表达检测

取EDTA抗凝骨髓标本1ml，用生理盐水稀释2倍，缓慢加于2ml淋巴细胞分离液上，3000r/min离心20min，吸取单个核细胞层，并用生理盐水洗涤3次后通过Trizol（Invitrogen公司）提取总RNA，具体按Trizol说明书操作。将RNA浓度调整至1μg/μl，逆转录试剂盒（TaKaRa公司）合成cDNA后通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）（TaKaRa公司）检测骨髓BCRP基因表达。所用引物序列如下：BCRP正向5'-GTTCTC AGCAGCTCTTCGGC-3'，反向5'-TCCTCCAGACACAC CACGGA-3'；β-actin正 向 5'-CCATTGGCAATGAG CGGTTC-3'， 反 向 5'-GTCTTTGCGGATGTCCACGT-3'，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反应体系如下：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2×）10μl，PCR正向引物（10μmol/L）0.2 μl，PCR反向引物（10 μmol/L）0.2 μl，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.4 μl，cDNA 1 μl，H2O 8.2 μl。qRT-PCR 在 ABI 7500仪进行，反应条件如下，95℃ 40 s，（95℃ 5 s、60℃ 35 s）×40个循环，记录熔解曲线和解链温度，每个样品做3个复孔，并计算平均值。将健康志愿者的BCRP平均表达水平定义为1，通过白血病患者的2-ΔΔCt法计算得出患者骨髓BCRP基因表达[6]。

1.3 预后随访

从初次确诊后开始随访，随访时间截止2016年9月，随访时间为1～35个月，中位随访时间为27个月。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，利用t检验比较组间差异；计数资料以百分比或率的形式表示，利用χ2检验进行分析；骨髓BCRP基因表达与患者生存期分析采用Kaplan-Meier生存曲线和Log-rank检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组BCRP基因表达比较

对67例白血病患者和50例健康志愿者的骨髓单个核细胞进行qRT-PCR检测。白血病患者BCRP基因表达为（3.0±1.2），较健康志愿者（1.2±0.6）升高（P＜0.01），见表1。

表1 急性白血病患者和健康志愿者情况比较

2.2 不同BCRP基因表达的AL患者情况比较

依照白血病患者BCRP基因表达均值（3.0），将其分为BCRP高表达组（4.1±0.7）和BCRP低表达组（2.1±0.5），两组间白血病患者年龄、性别和分型差异无统计学意义（P＞0.05）；BCRP高表达组白血病患者初始WBC计数较BCRP低表达组高，差异有统计学意义（P＜0.001），见表2。

2.3 不同BCRP基因表达的AL患者生存分析

AL患者的生存时间为25个月，其中BCRP高表达组急性白血病患者的中位生存时间为15个月，BCRP低表达组急性白血病患者的中位生存时间为31个月，两组生存分析比较差异有统计学意义（Logrank=21.78，P＜0.05），见附图。

表2 不同BCRP基因表达AL患者情况比较

附图 AL患者BCRP基因高低表达组间的生存曲线

3 讨论

随着社会生活方式的改变及环境污染问题的日渐严重，AL的发生率呈现出上升的趋势。而患者的疗效和预后各异，这与疾病的年龄、分型或基因异常等因素相关，目前对于临床AL预后判断尚缺乏特异性的指标[7]。而对于化疗的耐药是影响白血病疗效和预后的一个重要因素[8]，化疗耐药主要是受到ABC转运蛋白超家族的调控[9]，BCRP作为其中的一种日益受到研究者的关注。

本研究中，笔者首先检测AL组和健康志愿者骨髓BCRP基因表达情况，发现AL患者骨髓BCRP基因表达高于健康人（P＜0.01）。按照BCRP基因表达的均数值将白血病患者分为BCRP高表达组和BCRP低表达组，发现BCRP高表达组患者初始白细胞计数更高（P＜0.001），同时中位生存时间更短，生存分析比较有差异，提示骨髓BCRP基因表达水平可能作为一个AL患者预后判断的的生物学标志物。

BCRP基因定位于染色体4q22.1，其编码蛋白定位于细胞膜及细胞核，膜表面的BCRP能将化疗药物转运出细胞外，从而细胞内药物浓度，影响化疗疗效[10]。能够影响氨甲喋呤和阿霉素等常用化疗药物，引起多药耐药的发生[11]。以往的研究也证实，急性白血病时BCRP基因表达升高[12]，与本研究中的结论一致，且不同的骨髓BCRP基因表达组之间患者初始白细胞计数以及生存率也有差异，表明骨髓BCRP基因表达对于AL预后预测有一定的价值。同时，qRT-PCR技术检测基因表达水平，结果快速且准确，且易于临床检验的开展[13]。

综上所述，AL患者骨髓BCRP基因表达高于健康志愿者，且BCRP高表达患者的预后更差。骨髓BCRP基因表达对于AL的预后有着重要的意义，能为AL患者治疗方案的制定和优化提供依据，并辅助判断其预后，同时尚需更大样本量的研究以明确骨髓BCRP基因表达与AL预后的相关性，进一步提高其临床指导应用价值。

参 考 文 献：

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