三重 PCR 快速检测 H7N9 亚型流感病毒方法的建立

刘根梅，简茗琪，高 天

（韶关学院英东食品科学与工程学院，广东 韶关 512005）

流感病毒可分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三型。A型流感病毒可从野生和家养的温血动物（鸟和哺乳类）等广泛分离到。2013年在我国华东地区出现的H7N9 亚型流感病毒（AIV），即为A型流感病毒，因其对公共卫生构成巨大威胁而受到广泛关注。自2013年2月底在上海和安徽两地率先发现并确诊以来，我国已经历5波流行。根据世界卫生组织的报告，截至2017年10月26日，人感染H7N9亚型AIV累计报告病例数1 564例；2013 年 3 月至 2017 年 6 月，全国 （不含香港、澳门、台湾地区） 报告人感染 H7N9 亚型AIV共计1 445 例，死亡 562 例，病死率为 38.9%［1-2］。人感染的H7N9流感病毒是新亚型流感病毒，为全球首次发生［3-5］。Li 等［6］研究发现，82% 的患者有禽类接触史，并且从患者体内分离出的H7N9 病毒与活禽市场中家禽分离出的病毒株之间的基因序列非常接近。Chen等［7］在活禽市场采集的家禽标本中分离到 H7N9 禽流感病毒，这些分离株与从患者身上分离到的病毒株高度同源。在新型H7N9 流感病毒的8 个基因片段中，H7 片段来源于浙江鸭群中分离的禽流感病毒，并可追溯至东亚地区野鸟中分离的相似病毒；N9 片段与东亚地区野鸟中分离的禽流感病毒同源；其余 6 个基因片段（PB2、PB1、PA、NP、M、NS）则来源于 H9N2 禽流感病毒［8-9］。

在养禽业方面，虽然H7N9病毒弱毒株对家禽无致病性，但给我国养禽业（主要是鸡）造成了巨大的经济损失。2013 年以来，我国兽医主管部门制定了严格的 H7N9 流感防控措施，但并没有完全遏制 H7N9 病毒的扩散和传播。目前已在多个省市的活禽交易市场和部分省市的养殖场分离到 H7N9 病毒［10］。更重要的是，H7N9 病毒已经发生基因突变，由原来对家禽无致病力病毒株变为高致病性病毒株［11］。因此，建立 H7N9 亚型流感病毒的快速检测方法显得十分必要。其中，分子生物学技术因其具有快速、敏感和特异等优点，已广泛应用于 H7N9 流感病毒核酸检测，是目前众多学者研究的热点之一。本研究建立了一种能同时鉴别 H7 亚型、N9 亚型的三重 PCR方法，并对该方法的特异性、敏感性和准确性进行分析。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验在韶关学院英东动物疫病实验室完成。H7N9 亚型流感病毒模板、pMD-NA、pMDHA及pMD-M重组载体由中山大学惠赠，H1N1流感病毒模板、H9N2 流感病毒模板、传染性支气管炎病毒（IBV）、新城疫病毒（NDV）由本实验保存。

主要试剂：QIAamp Viral RNA Mini Kit ，购自 Qiagen 公司；PrimeScript®1st Strand cDNA Synthesis Kit、Takara Taq™ （with Mg2+free Buffer）、DL2000 DNA Marker，均购自 Takara 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计 从 NCBI下载甲型流感病毒及H7N9 亚型流感病毒的多条基因序列，用DNAman 软件对其进行同源性比较，确定H7亚型AIV HA基因、N9亚型AIV NA基因以及所有亚型AIV M基因的保守序列，设计出能检测H7亚型AIV、N9亚型AIV以及所有亚型AIV的3对特异性引物，通过NCBI Blast验证保证每对引物扩增出对应的病毒，不与其他病毒交叉。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物靶基因、引物名称、引物序列和扩增片段大小如表1所示。

表1 引物序列信息

1.2.2 病毒RNA的提取 根据QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒说明书抽提病毒RNA。利用 PrimeScript®1st Strand cDNA Synthesis Kit，以RNA为模板进行反转录。反转录体系20 μL：50 μmol/L Random 6 mers 1 μL，10 mmol/L dNTP Mixture 1 μL，5×PrimeScript II Buffer 4 μL，40 U/μL RNase Inhibitor 0.5 μL，200 U/μL PrimeScript II RTase 1 μL，模板 RNA 1 μg，RNase Free水补齐至 20 μL。

1.2.3 单重PCR 扩增 以cDNA为模板，用引物对H7-F/H7-R、N9-F/N9-R、M-F/M-R分别进行 PCR 扩增。反应体系50 μL：TaKaRa Taq（5 U/μL） 0.25 μL，10×PCR Buffer （Mg2+free）5 μL，25 mmol/L MgCl23 μL，dNTP Mixture（各 2.5 mmol/L） 4 μL，模板小于 500 ng，上下游引物浓度为0.2 μmol/L，灭菌水补齐至 50 μL。反应条件：预变性 94℃ 2 min；94℃ 30 s、50.2～60℃ 30 s、72℃ 45 s，30个循环；72℃延伸 10 min。其中最佳退火温度由梯度PCR确定，退火温度分别设置为50.2、51.5、52.6、54.0、57.2、59.2、60.0℃，PCR 产物经 2% 琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.4 三重PCR检测方法的建立及优化 以cDNA为模板，用引物对H7-F/H7-R、N9-F/N9-R、M-F/M-R进行三重PCR扩增。分别对退火温度、引物浓度、dNTP Mixture浓度和Mg2+浓度进行优化。

最适退火温度的确立：分别以50.2、51.5、52.6、54.0、57.2、59.2、60.0℃的退火温度进行梯度 PCR 反应，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳观察，根据不同退火温度下目的条带的亮度确定最适退火温度。

最适引物浓度的确立：设置上、下游引物终浓度分别为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μmol/L进行PCR 反应，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，确定最适引物浓度。

最适dNTP Mixture浓度的确立：设置dNTP Mixture浓度分别为 50、100、150、200、250、300、350 μmol/L进行PCR 反应，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，确定最适dNTP Mixture浓度。

最适Mg2+浓度的确立：设置Mg2+浓度分别为 0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25 mmol/L进行PCR 反应，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，确定最适Mg2+浓度。

1.2.5 三重PCR方法特异性试验 以H1N1、H9N2、NDV、IBV等常见病毒cDNA为模板，利用优化的三重PCR 方法分别进行扩增，检验该方法的特异性。

1.2.6 三重PCR方法敏感性试验 将pMDNA、pMD-HA及pMD-M重组质粒进行10倍梯度稀释，并利用优化的三重PCR 方法进行扩增，检验其敏感性。

1.2.7 临床样品检测 对韶关三鸟批发市场采集的470份咽肛拭子进行三重PCR检测。每10个拭子合并为1个样品，加入PBS缓冲液，提取RNA进行检测。同时将备份的混样样品采用世纪元亨公司的禽流感病毒H7亚型实时荧光RT-PCR检测试剂盒进行检测。

2 结果与分析

2.1 单重 PCR 扩增结果

提取H7N9 病毒RNA进行反转录，以cDNA为模板，用引物对H7-F/H7-R、N9-F/N9-R、M-F/M-R分别进行 PCR 扩增。通过琼脂糖凝胶电泳，分别获得大小为304、160、458 bp的条带，与预期片段大小相符。通过梯度PCR扩增，结果表明引物对H7-F/H7-R扩增基因时的最佳退火温度为59.2℃，引物对N9-F/N9-R扩增基因时的最佳退火温度为57.2℃，引物对M-F/M-R扩增基因时的最佳退火温度为57.2℃。

2.2 三重PCR检测方法的建立及优化

对三重PCR退火温度、引物浓度、dNTP Mixture浓度和Mg2+浓度进行优化。其中通过温度梯度PCR扩增，摸索最佳退火温度，结果见图1，退火温度为59.2℃时，扩增条带最为清晰，确定其为最佳退火温度。通过PCR扩增，摸索H7-F/H7-R引物对、N9-F/N9-R引物对、M-F/M-R引物对的最佳引物浓度，结果见图2，H7-F/H7-R引物对浓度为0.6 μmol/L时，扩增条带最为清晰，确定其为最佳引物浓度；N9-F/N9-R引物对浓度为0.2 μmol/L时，扩增条带最为清晰，确定其为最佳引物浓度；M-F/M-R引物对浓度为0.3 μmol/L时，扩增条带最为清晰，确定其为最佳引物浓度。结合上述优化条件，设置dNTP Mixture浓度梯度，结果最佳dNTP Mixture浓度为250 μmol/L（图3）；设置Mg2+浓度梯度，结果见图4，在浓度为0.75 mmol/L 时几乎没有条带，在 1.0 mmol/L 时开始出现条带，在浓度大于1.25 mmol/L 条件下有相应3条条带，为保证扩增效率，选择最佳Mg2+浓度为1.50 mmol/L。三重PCR 最佳反应模式为：预变性 94℃ 2 min；94℃ 30 s、59.2℃ 30 s、72℃ 45 s，30个循环；72℃延伸 10 min。

图1 三重PCR退火温度梯度电泳结果

图2 引物浓度梯度电泳结果

图3 dNTP Mixture浓度梯度电泳结果

图4 Mg2+浓度梯度电泳结果

2.3 三重PCR方法特异性试验

利用所建立的三重PCR方法进行特异性试验，分别对H7N9、H1N1、H9N2、IBV、NDV 进行检测，结果见图5，H7N9亚型流感病毒模板可扩增出3条特异性条带，分别为304、160、458 bp，与预期相符，H1N1和H9N2亚型流感病毒模板则只扩增出458 bp的流感病毒通用条带，而IBV、NDV均无任何扩增条带出现，表明该方法具有良好的特异性。

图5 特异性试验电泳结果

2.4 三重PCR方法敏感性试验

将pMD-NA、pMD-HA及pMD-M重组质粒进行10倍梯度稀释，分别为6 ng～0.006 pg，利用所建立的三重PCR方法进行扩增，结果见图6，重组质粒稀释至0.6 pg时，可扩增出3条特异性条带，而稀释至0.06 pg以下时，则几乎无扩增条带出现，表明所建立的三重PCR方法最低能检出0.6 pg的模板，说明该方法具有良好的敏感性。

图6 敏感性试验电泳结果

2.5 临床样品检测

使用建立的三重PCR方法对市场采集的470份咽肛拭子进行检测，结果显示，没有检测出H7N9阳性样品，但是其中有4份样品扩增出458 bp的AIV通用条带，表明这4份样品感染了其他亚型的流感病毒。采用世纪元亨公司的禽流感病毒H7亚型实时荧光RT-PCR检测试剂盒进行检测，也未检出阳性，证实所建立的三重PCR检测方法的准确性。

3 结论与讨论

H7N9 亚型流感病毒是一种新型的流感病毒，能引起人感染死亡，给养禽业造成重大的经济损失，对公共卫生安全构成重大威胁［3］。研究表明，H7N9 亚型流感病毒 HA发生了G186V 及 Q226L 关键氨基酸位点的变异，从而使得新型 H7N9 禽流感病毒更易与人上呼吸道SAα-2、6-Gal 受体结合，使其感染人的能力增强［12］。更重要的是，研究发现H7N9 病毒已经发生基因突变，由原来对家禽无致病力病毒株变为高致病性病毒毒株。因此，加强源头控制，及时发现H7N9 亚型流感病毒则显得尤为重要。而分子生物学技术因其具有快速、敏感和特异等优点，已广泛应用于 H7N9 流感病毒核酸检测，是目前众多学者研究的热点之一。其中实时荧光定量 RT-PCR检测方法已大规模用于流感监测，实时RT-PCR检测方法也是用于RNA病毒基因检测最普遍的方法，也较为广泛用于H7N9 流感病毒的核酸检测［13-14］。多重 RT-PCR法因其具有多个特异性引物，在一个反应中可同时检测多个病毒亚型，是一种经济有效的检测方法，因而得到广泛应用［15-19］。

本研究针对 H7 亚型流感病毒的 HA 基因、N9 亚型流感病毒的 NA 基因和所有亚型流感病毒 M 基因的保守序列，分别设计了多对特异性引物，并通过实验，将3对最佳特异性引物组合在一起，并分别对退火温度、引物浓度、dNTP Mixture浓度和Mg2+浓度进行优化，建立了H7N9亚型流感病毒三重PCR检测方法。该方法检测可确定H7N9亚型流感病毒，也可鉴别H7亚型流感病毒、N9亚型流感病毒或其他亚型流感病毒。

本研究所建立的三重PCR方法，对于H7N9模板可扩增出3条特异性条带，即304、160、458 bp，H1N1和H9N2模板可扩展出458bp的 AIV 通用条带，而 IBV、NDV 均无任何扩增条带出现，表明该方法具有良好的特异性。通过敏感性试验，本方法最低能检出 0.6 pg 的模板，证明该方法的敏感性较高。本研究建立的三重PCR方法，为快速鉴别和监测 H7N9 亚型流感病毒提供了技术手段，特别是对于尚不具备荧光定量 RT-PCR 检测条件的实验室，该方法是一种鉴别 H7N9 病毒的重要检测方法。

参考文献：

［1］WHO. Human infection with avian influenza A（H7N9） virus China［EB/OL］.http：//www.who.int/csr/don/26-october-2017-ah7n9-china/zh/.

［2］中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.疫情［EB/OL］. http：// www.nhfpc.gov.cn/zwgkzt/yqgg/list.shtml. 2017-07-24

［3］Gao R，Cao B，Hu Y，etal. Human infection with a novel avian-origin influenza A（H7N9）virus［J］. N Engl J Med，2013，368（20）：1888-1897.

［4］Feng Y，Mao H，Xu C，et al. Origin and characteristics of internal genes affect infectivity of the novel avian-origin influenza A（H7N9）virus［J］. PLoS One，2013，8（11）：e81136.

［5］Wu S，Wu F，He J. Emerging risk of H7N9 influenza in China［J］. Lancet，2013，381（9877）：1539-1540.

［6］Li Q，Zhou L，Zhou M，et al. Epidemiology of human infections with avian influenza A（H7N9）virus in China［J］. N Engl J Med，2014，370（6）：520-532.

［7］Chen Y，Liang W，Yang S，et al. Human infections with the emerging avian influenza A H7N9 virus from wet market poultry：clinical analysis and characterisation of viral genome［J］.Lancet，2013，381（9881）：1916-1925.

［8］毛青. 科学认识H7N9，有效防控人感染禽流感病毒［J］. 第三军医大学学报，2013，35（8）：693-695.

［9］Liu D，Shi W，Shi Y，etal. Origin and diversity of novel avian influenza A H7N9 viruses causing human infection：phylogenetic，structural，and coalescent analyses［J］. Lancet，2013，381（9881）：1926-1932.

［10］农业部. 2017年5月全国动物H7N9流感监测情况［EB/OL］.http：//www.moa.gov.cn/sjzz/syj/dwyqdt/jczt/201706/t20170619_5706742.htm，2017-07-14.

［11］蒋文明，侯广宇，李金平，等. H7N9亚型流感候选疫苗株的构建及免疫效力试验［J］. 中国动物检疫，2017，34（6）：86-89.

［12］Xiong X，Martin SR，Haire LF，et al. Receptor binding by an H7N9 influenza virus from humans［J］. Nature，2013，499（7459）：496-499.

［13］王云鹤，包红梅，孙佳善，等. H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法建立［J］. 中国农业科学，2015，48（15）：3050-3055.

［14］蒋文明，李金平，于美芳，等. 双重RT-PCR快速检测H7N9流感病毒方法的建立［J］. 中国动物检疫，2015，32（05）：65-68，81.

［15］Zhu Z，Fan H，Qi X，etal. Development and evaluation of a SYBR green-based real time RTPCR assay for detection of the emerging avian influenza A（H7N9）virus［J］. PLoS One，2013，8（11）：e80028.

［16］Wang R，Taubenberger J K. Methods for molecular surveillance of influenza［J］. Expert Rev Anti Infect Ther，2010，8（5）：517-527.

［17］罗宝正，莫秋华，李儒曙，等. 新型H7N9亚型禽流感病毒多重荧光RT-PCR快速检测方法的建立［J］. 病毒学报，2014，30（1）：1-5.

［18］张慧蓉，秦桂平，李蓉，等. H7N9亚型AIV荧光定量RT-PCR技术建立及在活禽市场的应用［J］. 中国兽医学报，2017，37（1）：78-82，96.

［19］罗思思，谢芝勋，刘加波，等. H7N9亚型AIV双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立［J］.动物医学进展，2013，34（12）：1-5.