BSL-4实验室设施和关键设备生物防护风险研究

胡凌飞，靳爱军，张柯，刘波波，杜涛，李劲松，李娜

近年来，高致病性病原微生物引发的烈性传染病在全球范围内呈现扩散趋势，新发突发传染病的不断暴发，人类社会公共健康和环境受到严重威胁，为保障国内控制传染病的突发事件应急安全以及提升生物国防实力的重大需求，世界各国开始加紧建设高等级病原微生物实验室[1-4]。2015 年初我国首个生物安全四级实验室（BSL-4）在中国科学院武汉病毒所竣工，成为国内首个生物安全防护等级最高的实验室。

高等级生物安全实验室风险评估包括很多方面，有病原微生物危害评估、实验室试验活动风险评估、设施设备安全风险评估以及人员防护风险评估等。设施设备硬件条件是确保生物安全的基础，其中，一级防护屏障保护的目标是实验室工作人员，实现人员与操作对象（即感染性材料）之间的隔离，以消除或减少人员暴露于感染性材料。一级防护屏障包括动物隔离设备、生物安全柜、个人防护装备等。二级防护屏障保护目标是实验室的外部环境，防止实验中使用的感染性材料和实验活动过程中产生的感染性材料扩散到实验室外，造成外环境污染，引发传染性疾病的流行。二级防护屏障包括建筑结构、通风空调系统、消毒灭菌系统等[5-8]。本研究采用粘质沙雷菌和噬菌体 ΦX174 作为高致病性细菌和病毒的替代物，通过替代微生物气溶胶对 BSL-4 实验室的设施和关键防护设备进行生物防护风险的研究，为高等级生物安全实验室风险评估提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株 实验用菌株为粘质沙雷菌8039 由本所保藏，大肠杆菌（ATCC13706）和大肠杆菌噬菌体 ΦX174（ATCC13706-B1）购于ATCC 菌种保藏中心。采用普通营养琼脂培养基（TSA）、普通营养琼脂半固体培养基和营养肉汤培养基培养。

1.1.2 主要试剂及仪器 生物气溶胶发生采样一体机和 Collison 气溶胶发生器为美国 BGI 公司产品；Andersen 六级空气微生物采样器为青岛众瑞智能仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 生物防护效果测试系统 BSL-4 实验室设施和关键设备的生物防护效果测试系统包括生物气溶胶发生单元、生物气溶胶采集单元和生物气溶胶进样单元，如图 1 所示。利用此测试系统在运行正常的 BSL-4 实验室内测试生物安全设施设备是否存在生物安全风险。实验中气溶胶发生器为Collison 气溶胶发生器，高等级生物安全实验室设施设备的下游生物气溶胶浓度一般较低，因此下游生物气溶胶采集单元采用 Andersen 六级采样器。

图1 生物防护效果测试系统构成示意图Figure 1 The schematic diagram of the biological protective test system

图2 生物气溶胶发生采样一体机结构示意图Figure 2 The structure sketch map of the microbiological aerosol sampling unit

根据高等级生物安全实验室各种设施和关键设备对生物气溶胶防护的要求，上游既包括生物气溶胶发生，又有生物气溶胶采样，考虑到实验现场的操作需求，采用了自主研制的生物气溶胶发生采样一体机，结构如图 2 所示。生物气溶胶发生采样一体机可将生物气溶胶的发生与采样集成为一体，在机体的左右两侧分别设计可以横向和纵向抽拉的收缩杆，分别支撑生物气溶胶发生器和采样器，生物气溶胶发生器的发生距离和高度可以在一定范围内调整。通过微控制器控制气流流量、工作模式、工作时间等，仪器内置蓝牙通讯模块，可以通过遥控器远距离控制仪器运行，避免了人为干扰和实验人员的气溶胶暴露危险。

1.2.2 实验室设施对微生物气溶胶防护效果的检测方法

1.2.2.1 排风高效空气过滤器 生物气溶胶发生单元在 BSL-4 实验室的一个排风高效空气过滤器单元正下方 62 cm 处发生微生物气溶胶，发生5 min 后用上游生物气溶胶采集单元在排风高效空气过滤器单元下方 40 cm 处采集本底样本 20 s，用下游生物气溶胶采集单元在排风高效空气过滤器单元采样口采集生物气溶胶样本 5 min，采样后取出平皿进行培养计数并计算防护效率（即排风高效过滤器对微生物气溶胶的过滤效率）。

1.2.2.2 气密门 生物气溶胶发生单元在四级实验室的一个气密门门缝正前方发生微生物气溶胶，发生 5 min 后用上游生物气溶胶采集单元在气密门门缝正前方采集本底样本 20 s。用下游生物气溶胶采集单元在气密门另一侧的门缝正前方采集生物气溶胶样本 5 min，采样过程中按“开门”按钮使气密门气压下降，模拟气溶胶泄漏事故，采样后取出平皿进行培养计数并计算防护效率。

1.2.2.3 传递窗 生物气溶胶发生单元分别在压力为 –70 Pa 的传递窗和 –40 Pa 的实验室里发生微生物气溶胶，发生 5 min 后用上游生物气溶胶采集单元采集本底样本 20 s，用下游生物气溶胶采集单元采集生物气溶胶样本 5 min，如图 3A 和图 3B 所示，采样后取出平皿进行培养计数并计算防护效率。

1.2.3 实验室关键设备对微生物气溶胶防护效果的检测方法

1.2.3.1 动物饲养隔离器

小动物饲养隔离器检测：因小动物饲养隔离器较小放不下气溶胶发生装置，所以气溶胶发生单元在小动物饲养隔离器外通往总排风管道的一个排风口发生微生物气溶胶，发生 5 min 后用上游生物气溶胶采集单元在此隔离器的同一个排风管的下方排风口采集本底样本 20 s，用下游生物气溶胶采集单元在小动物饲养隔离器的总排风管道高效过滤器口采集生物气溶胶样本 5 min，采样后取出平皿进行培养计数并计算防护效率。

中型动物饲养隔离器检测：生物气溶胶发生单元在中型动物饲养隔离器的隔离舱内发生微生物气溶胶，发生 5 min 后用上游生物气溶胶采集单元在中型动物饲养隔离器的隔离舱内口采集本底样本 20 s，用下游生物气溶胶采集单元在中型动物饲养隔离器的排风口采集生物气溶胶样本 5 min，采样后取出平皿进行培养计数并计算防护效率。

图3 传递窗防护效率测试示意图（A：在 –70 Pa 的传递窗里发生气溶胶；B：在 –40 Pa 的实验室里发生气溶胶）Figure 3 The schematic diagram of the transfer window (A: Bioaerosols occur in the –70 Pa transfer window; B: Bioaerosols occur in the –40 Pa laboratory)

1.2.3.2 正压防护服 在 6 m2的密闭空间内，实验人员穿上正压防护服，连接生命支持系统，用生物气溶胶发生单元在正压防护服外发生微生物气溶胶，发生 5 min 后用上游生物气溶胶采集单元在发生单元前方采集本底样本 20 s，用下游生物气溶胶采集单元在正压防护服内采集生物气溶胶样本5 min，采样过程中断开生命支持系统，模拟正压防护服无正压状态，采样后取出平皿进行培养计数并计算防护效率。

1.2.3.3 生物安全柜高效过滤器 在生物安全柜正常运行的情况下，用生物气溶胶发生单元在生物安全柜内发生微生物气溶胶，发生 5 min 后用上游生物气溶胶采集单元在发生单元前方采集本底样本 20 s，用下游生物气溶胶采集单元在排风高效空气过滤器单元采样口采集生物气溶胶样本 5 min，采样后取出平皿进行培养计数并计算防护效率（即排风高效过滤器对微生物气溶胶的过滤效率）。

1.2.4 微生物气溶胶粒径的测量 将采样平皿放入恒温培养箱中培养，计数每个平板上的菌落数（或噬菌斑数），根据各级采样平板的校正菌落数（噬菌斑数）[9]计算气溶胶颗粒数量中值直径。依据 Anderson 六级采样器每一级捕获的粒子大小不同（一级 〉 7 μm、二级为 4.8 ～ 7 μm、三级为3.4 ～ 4.7 μm、四级为 2.1 ～ 3.3 μm、五级为 1.1 ～2.0 μm、六级为 0.6 ～ 1.0 μm），把六级采样器捕获的粒子作为 6 组大小不同数据，根据偏态分布50% 中值直径的计算公式进行计算。

数量中值直径公式：P50= L +（i/f）（50%n – C）。公式中 L 为累计频数中值的组距下限；i 为累计频数中值的组距；f 为累计频数中值的粒子数；50%n为累计频数中值所在组的累计频数；C 为累计频数中值[10]。

1.2.5 微生物气溶胶防护效果计算方法 粘质沙雷菌采样平板 30 ℃ 恒温培养 24 ～ 48 h，大肠杆菌噬菌体 ΦX174 采样平板倒上层后 37 ℃ 恒温培养 24 h。Andersen 六级采样平板按照文献[2]校正后的菌落数（或噬菌斑数）及采样流量（28.3 L/min）、采样时间计算设施和关键设备对微生物气溶胶的防护效率。

⑴上游微生物气溶胶浓度（CFU/m3或PFU/m3）的计算：

⑵下游微生物气溶胶浓度（CFU/m3或PFU/m3）的计算：

⑶实验室设施和关键设备对微生物气溶胶的防护效率：P =（1 – At/A0）× 100%

2 结果

2.1 微生物气溶胶粒子大小

粘质沙雷菌气溶胶颗粒数量中值直径平均为2.21 μm，噬菌体 ΦX174 气溶胶颗粒数量中值直径平均为 2.18 μm。

2.2 实验室设施防护效果

本研究所测试的生物安全四级实验室设施对生物气溶胶的防护效率基本达到 99.9% 以上，气密门在模拟意外泄漏操作的情况下依然达到超过99.99% 的防护效率（表 1）。

2.3 实验室关键设备的防护效果

生物安全四级实验室关键设备对生物气溶胶的防护效率都达到了 99.99% 以上，正压防护服在模拟生命支持系统断开，发生意外的情况下也达到超过 99.99% 的防护效率（表 2）。

表1 BSL-4 实验室设施防护效果测试结果Table 1 Test results of protective effect of facilities in BSL-4 laboratory

表2 BSL-4 实验室关键设备防护效果测试结果Table 2 Test results of protective effect of key equipment in BSL-4 laboratory

3 讨论

对生物安全实验室来说，设施设备等硬件是基础，是生物安全实验室建设最重要的一个环节，符合国家和行业标准，具备良好的防护效果是保障实验室生物安全，确保实验活动正常开展的前提[8]。生物安全实验室在施工完成后所有设施和关键设备都要经过具备专业检测资质/资格的第三方检测机构依据相关国家标准进行现场测试，如高等级生物安全实验室排风高效过滤器测试法有扫描/全效率捡漏法[1]，围护结构及气密门检测有压力衰减法[11]、烟雾检测法，动物隔离设备有内外压差法等。这些检测方法一般通过检测压力变化或发生无生物活性的物理颗粒气溶胶进行检漏测试，但钠盐雾、固体粉尘或油性颗粒等物理粒子，与生物气溶胶粒子理化性质不同。空气微生物模式细菌粘质沙雷菌是细菌中最小者，常用于检测滤菌器质量，国外使用的模拟病毒指示微生物噬菌体 MS2 多用于滤材过滤效果评价[12-13]。不同种类的微生物气溶胶具有不同的粒径分布特征，其中病毒、支原体和细菌等粒径主要集中在 2 μm 以下，室内微生物气溶胶粒径为 1 ～ 10 μm，粒径小于 10 μm 的粒子能较长时间飘浮在空气中，并可被人呼吸系统吸入[12,14]。本研究人工发生的粘质沙雷菌和噬菌体 ΦX174气溶胶颗粒主要分布于 1.1 ～ 4.7 μm 之间，其数量中值直径分别为 2.21 μm 和 2.18 μm，位于室内空气微生物气溶胶粒子大小范围内，因此可以真实地模拟致病性生物气溶胶粒子发生泄漏后正常运行着的实验室设施设备对其的防护效果，同时也是对物理气溶胶粒子测试法的进一步验证。

测试结果表明 BSL-4 实验室内的设施设备在正常运行的情况下，发生生物气溶胶泄漏风险的概率很小。实验室硬件设施固然重要，而如何确保硬件设施科学、有效地安全运行和维护保养更为重要，设施设备的日常运行管理要包括正常操作使用、日常维护保养、定期检测等[8]。实验室生物安全风险评估应由多项评估方案共同构成，完善的硬件设施，实验人员职业培训加上科学有效的组织管理体系、管理机制和管理制度才能在最大程度上降低安全风险。

[1] Zhang X. Research on key issues and development strategies of biosafety level 4 laboratory. Beijing: Academy of Military Medical Sciences, 2016. (in Chinese)章欣. 生物安全 4级实验室建设关键问题及发展策略研究. 北京:中国人民解放军军事医学科学院, 2016.

[2] Zaki AN. Biosafety and biosecurity measures: management of biosafety level 3 facilities. Int J Antimicrob Agents, 2010, 36 Suppl 1:S70-S74.

[3] Liang HG, Huang C, Ma HX, et al. High-level biosafety laboratories and biosafety. Bull Chin Acad Sci, 2016, 31(4):452-456. (in Chinese)梁慧刚, 黄翠, 马海霞, 等. 高等级生物安全实验室与生物安全.中国科学院院刊, 2016, 31(4):452-456.

[4] Shurtleff AC, Garza N, Lackemeyer M, et al. The impact of regulations, safety considerations and physical limitations on research progress at maximum biocontainment. Viruses, 2012, 4(12):3932-3951.

[5] General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People's Republic of China, Standardization Administration of the People's Republic of China. GB 19489-2008 Laboratories—General requirements for biosafety. Beijing: China Standards Press, 2009. (in Chinese)中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局, 中国国家标准化管理委员会. GB 19489-2008 实验室 生物安全通用要求. 北京: 中国标准出版社, 2009.

[6] National Health and Family Planning Commission of the People's Republic of China. WS 233-2017 General biosafety standard for causative bacteria laboratories. (in Chinese)中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会. WS 233-2017 病原微生物实验室生物安全通用准则.

[7] Meng KY, Wang CY, Wan ZH. Describe the safety precaution of high level biological safety laboratory. Disaster Med Rescue (Electron Ed),2017, 6(2):112-115. (in Chinese)孟轲音, 王承宇, 万忠海. 试述高等级生物安全实验室的安全防范.灾害医学与救援(电子版), 2017, 6(2):112-115.

[8] Zhao SQ, Wang H, Li P. Facility & equipment of bio-safety laboratory.Beijing: Military Medical Press, 2017:1-17. (in Chinese)赵四清, 王华, 李萍. 生物安全实验室设施与设备. 北京: 军事医学出版社, 2017:1-17.

[9] Andersen A. New sampler for the collection, sizing, and enumeration of viable particles. J Bacteriol, 1958, 76(5):471-484.

[10] Hu LP. Test medical research design and statistical analysis. Beijing:People's Medical Publishing House, 2004:238. (in Chinese)胡良平. 检验医学科研设计与统计分析. 北京: 人民军医出版社,2004:238.

[11] Cao GQ, Wang R, Zhai PJ. Discussion on building envelope air tightness test of high-level biosafety laboratories. Heating Ventilating Air Conditioning, 2016, 46(12):74-79. (in Chinese)曹国庆, 王荣, 翟培军. 高等级生物安全实验室围护结构气密性测试的几点思考. 暖通空调, 2016, 46(12):74-79.

[12] Yu L. Model virus (phage) separation, characterization and application research in the evaluation of protective equipment and facilities.Beijing: Academy of Military Medical Sciences, 2010. (in Chinese)于龙. 模式病毒(噬菌体)分离、特性及在防护装备和设施评价中的应用研究. 北京: 中国人民解放军军事医学科学院, 2010.

[13] Wen ZB, Chen Y, Du Q, et al. Contamination of microbiological aerosol generated by pathogenic microbiological labs. Milit Med Sci,2013, 37(1):1-5. (in Chinese)温占波, 陈咏, 杜茜, 等. 病原微生物实验室实验操作对室内空气产生微生物污染的研究. 军事医学, 2013, 37(1):1-5.

[14] Che FX, Yu XH. The theory and application of air microbiological inspection. Beijing: Enyclopedia of China Publishing House, 1998. (in Chinese)车凤翔, 于玺华. 空气微生物采样理论及其技术应用. 北京: 中国大百科全书出版社, 1998.