16种中草药提取物对2株草鱼致病菌的体外抑杀菌作用

李赫，胡宗云，张健，宋文华，富丽静

（辽宁省淡水水产科学研究院，辽宁省水生动物病害防治重点实验室，辽宁 辽阳 111000）

草鱼肉质细嫩、营养价值高，倍受人们的青睐，已成为池塘高密度集约化养殖的主要种类之一。但是，由于养殖密度过高、水体环境恶化，病害越来越严重，给草鱼养殖业带来了十分巨大的损失。而长期大量使用抗生素会出现耐药菌株和变异株，有效防治更加困难。中草药是天然药物，资源丰富，安全性高、毒副作用少，残留低、不易引起药源性疾病和产生耐药性，对环境污染少[1,2]；中草药还有促进生长、调节免疫力和提高机体抗病力等作用[3,4]。金珊等[5]研究了中草药对海水养殖鲈病原菌的抑菌效果；李茜等[6]试验了23种中草药及复方对鲫肠道3种细菌的体外抑菌效果；陶健等[7]研究了21种、陈霞等[8]研究了47种中草药及复方制剂对嗜水气单胞菌的体外抑菌效果，都证明中草药具有良好的抗菌抑菌作用。本试验研究了16种中草药对2株草鱼致病性细菌的体外抑菌效果，从中筛选出对两种致病菌有较好抑菌作用的药物，为防治该致病菌引起的疾病提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

实验用菌株由本实验室从辽宁地区池塘患病草鱼内脏中分离、保存，分别编号为H4和H35。回归感染实验证实该菌株为致病菌，致病性较强。生理生化试验和16S rDNA序列分析证明，H4为嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila，H35为类志贺邻单胞菌Plesiomonas Shigelloides。

1.1.2 培养基

液体培养基配方为：蛋白胨10g、牛肉膏3g、盐5g、蒸馏水 1 000mL，pH 调至 7.0～7.2。固体培养基为每1 000mL液体培养基加入18 g琼脂。

1.1.3 中草药

实验所用的16种中草药为地肤子、小茴香、茯苓、蛇床子、牡丹皮、黄芪、陈皮、藿香、猪苓、高良姜、黄柏、苦参、昆布、肉桂、姜黄和丁香，购自辽阳市博大药房。

1.2 方法

1.2.1 药液的制备

将16种中草药分别放于60℃恒温干燥箱中烘至恒重后粉碎，80目筛过滤备用。称取50g中草药，加500mL蒸馏水，室温浸泡24h后，文火煎煮30 min，滤出煎液，重复三次，合并滤液，浓缩至生药含量1g/mL，121℃灭菌20min，置4℃冰箱中保存备用。

1.2.2 抑菌效果的测定

采用琼脂扩散法测定抑菌效果：用打孔机将1#定性滤纸打成直径为6mm的圆形纸片，经121℃灭菌20min后，分别浸入各中药水提液中，待其干燥后，在无菌条件下平铺在涂有菌液的固体培养基平板上；对照组用无菌蒸馏水浸泡纸片。28℃下培养24h后，测定抑菌圈直径。

结果判定：抑菌圈直径≥20mm为极敏，用“+++”表示；15～19mm 为高敏，用“++”表示；10～14mm为中敏，用“+”表示；＜10mm以下为低敏，用“-”表示[9]。

1.2.3 菌悬液的制备

挑取适量冻干菌种，接种于液体培养基中，置于28℃恒温培养箱内培养24h，以接种环蘸取菌液在琼脂平板上划线，培养24h，挑取单个菌落接种于固体培养基上，28℃下培养18h后，用无菌生理盐水将菌体冲洗下来。使用麦氏比浊法，将菌液浓度稀释至1×107CFU/mL，置于4℃冰箱中保存备用。

1.2.4 最小抑菌质量浓度（MIC）测定

采用二倍稀释法[10]测定16种中草药药液对两株细菌的最小抑菌质量浓度（MIC）。每种中草药取灭菌试管7支，分别编号；第1号试管内加入2.5mL药物原液，2～7号试管每支加2.5mL液体培养基，2号管加2.5mL药液，充分混匀后吸取2.5mL至3号试管中，依次倍比稀释至7号试管，弃去2.5mL。1～7号试管均加入100μL菌液，摇匀，每种中草药重复3次；另准备3支试管作为对照管，在其中加入2.5mL液体培养基和100μL菌液。将所有试管放置于28℃培养箱中培养24h后，观肉眼察结果。药物最低浓度管中无细菌生长者即为最小抑菌质量浓度（Minimal InhibitoryConcentration，MIC）。

1.2.5 最小杀菌质量浓度（MBC）测定

在最小抑菌质量浓度试验基础上，从无明显细菌生长的试管中用涂布棒蘸取营养液，涂布于琼脂平板培养基，放于28℃培养箱中培养24h后观察结果。以平板培养基上无菌落生长的最低药物浓度作为最小杀菌质量浓度（Minimal Bactericidal Concentration，MBC）。

2 结果与分析

2.1 不同中草药的抑菌效果比较

16种中草药对两株细菌的抑菌活性各不相同（表1）。其中，茯苓、昆布和姜黄对H4的抑菌圈明显，直径分别为（23.86±0.22）mm、（21.73±0.71）mm、（20.73±0.33）mm，抑菌作用强（＋＋＋）；小茴香、肉桂对H4抑菌作用中等（＋＋）；蛇床子、丁香对H4抑菌作用低（＋）；地肤子等9种中草药对H4无抑菌作用（-）。黄芪、丁香对H35抑菌圈明显，直径分别为（17.66±0.35）mm、（18.93±0.37）mm，抑菌作用中等（＋＋）；牡丹皮、肉桂对H35抑菌作用低（＋）；地肤子等10种中草药对H35无抑菌作用（-）。

表1 16种中草药对H4和H35的抑菌效果Tab.1 Antibacterial effect of 16 kinds of Chinese herbal medicine on H4 and H35

2.2 不同中草药对2株细菌的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度

16种中草药有效成分对2株细菌的MIC和MBC的测定结果见表2。茯苓对H4的MIC和MBC最小，MIC 为 15.63mg/mL，MBC 为 31.25mg/mL；小茴香、昆布、姜黄次之，其MIC均为31.25mg/mL，其MBC分别为125mg/mL、125mg/mL和62.5mg/mL；蛇床子、肉桂、丁香、猪苓、黄柏对H4也有一定的抑菌作用，其MIC分别为125mg/mL、62.5mg/mL、125mg/mL、250mg/mL和250mg/mL，其MBC分别为250mg/mL、62.5mg/mL、125mg/mL、500mg/mL 和 500mg/mL；地肤子、牡丹皮、黄芪、陈皮、藿香、高良姜、苦参对H4的MIC和MBC最大，其MIC和MBC均大于1 000 mg/mL。

丁香对H35的MIC和MBC最小，MIC和MBC均为31.25mg/mL；黄芪、牡丹皮、陈皮、肉桂、高良姜次之，MIC 分别为 62.5mg/mL、125mg/mL、125mg/mL、250mg/mL 和 125mg/mL，MBC 分别为 125mg/mL、125mg/mL、250mg/mL、500mg/mL和 125mg/mL；地肤子、小茴香、茯苓、蛇床子、藿香、猪苓、黄柏、苦参、昆布、姜黄对H35的MIC和MBC最大，其MIC和MBC均大于1 000mg/mL。

表2 16种中草药对H4和H35的MIC和MBCTab.2 MIC and MBC of 16 kinds of Chinese herbal medicine on H4 and H35

3 讨论

类志贺邻单胞菌是一种人畜共患菌，不仅能引起人类菌血症、肠胃炎、脑膜炎等[11,12]，也是鱼类的一种潜在致病菌，对罗氏沼虾、斑点叉尾等[13,14]多种水生动物均有致病性。类志贺邻单胞菌对草鱼的感染死亡报道较少。胡钱东[15]等首次报道了志贺邻单胞菌是草鱼肌肉糜烂病的致病菌，对草鱼有致病性。张新艳等[16]报道了志贺邻单胞菌引起草鱼的发病率可达50%以上，死亡率为10%～15%。

嗜水气单胞菌是我国流行比较广泛的一种人畜共患的条件致病菌，是淡水鱼类爆发性传染病的主要病原菌之一，给水产养殖业造成了巨大的经济损失[17]。嗜水气单胞菌对草鱼具有很强的致病性，主要引起细菌性败血症，以全身出血为主要症状，同时感染或混合感染嗜水气单胞菌也可引起肠炎和烂鳃症状[18]。草鱼细菌性败血症是引起经济损失最为严重的病害之一。

目前，在渔业生产中，主要使用抗生素防治细菌性疾病，但滥用、错用和不规范使用抗生素，不仅导致严重的药物残留，威胁人类健康，还会增加耐药菌株，增强耐药性[19]，因而中草药的应用日益受到关注。中草药在水产动物疾病防治中的应用已有报道。汪黎虹等[20]测定了10种中药对18株鳗鲡（Anguilla japonica Temminck et Schlegel）常见致病菌的抑制效果，发现10种中药对除B12以外的17株养殖鳗鲡主要致病菌均有一定的抑制作用。张海宾等[21]选取12种中草药对嗜水气单胞菌的敏感性试验表明，五倍子、大黄、乌梅、黄芩、黄连的抑菌圈直径大，抑菌浓度低，药效持久。

本试验测定了16种中草药对2株草鱼致病菌的抑杀菌效果。结果表明，对嗜水气单胞菌（H4）的抑菌效果由高到低依次为：茯苓＞小茴香、昆布、姜黄＞肉桂＞蛇床子、丁香＞猪苓、黄柏；对类志贺邻单胞菌（H35）的抑菌效果由高到低依次为：丁香＞黄芪＞牡丹皮、陈皮、肉桂、高良姜。本实验结果显示，姜黄对嗜水气单胞菌的抑菌圈直径为（20.73±0.33）mm，这与喻鹏飞等[22]报道的结果相一致，说明姜黄对嗜水气单胞菌有较好的抑菌效果；丁香和黄柏对嗜水气单胞菌的MIC分别为125mg/mL和250mg/mL，这与张文青等[23]（50mg/mL和100mg/mL）的报道不同。赖晓健等[24]研究发现，丁香对太平洋双色鳗鲡Anguilla bicolor pacifica致病性类志贺邻单胞菌的抑菌效果最好，其MIC为4mg/mL，而本试验中丁香对类志贺邻单胞菌的MIC为31.25mg/mL，出现上述差异可能有两个原因，一是中草药产地不同，二是细菌来源不同。本试验结果表明，可以用中草药防治由该2株细菌引起的水产动物疾病，但中草药在体内的抗菌效果与体外并不一致，其有效成分在体内和体外发挥作用的环境相差较大，体内的各种消化液、酶、激素等化学成分影响很大，所以本试验结果仅供参考。同种中草药对不同菌株的抑制作用也不同，实际应用时应先确定致病菌的种类，再区别用药。

综上所述，茯苓和丁香可以分别作为嗜水气单胞菌和类志贺邻单胞菌引起的水产动物疾病的有效防治药物，其次是小茴香、昆布、姜黄、肉桂、蛇床子、丁香、猪苓、黄柏（H4）及黄芪、牡丹皮、陈皮、肉桂、高良姜（H35）。用中草药防治鱼病时，可根据药物的性质，适当配伍，发挥药物的协同作用，提高疗效。

［1］张传亮,李槿年,李小飞.拟态弧菌的致病性、耐药性及中草药防治弧菌病应用［J］.水利渔业,2007,27（1）:96-98.

［2］王玉娥,邢晨光,王国良.5种海洋致病弧菌对34种中草药敏感性的测定［J］.水产科学,2008,27（5）:221-225.

［3］王斌,赵文,范薇,等.复方中药制剂对草鱼免疫细胞功能及抗病力影响的初步研究［J］.大连水产学院学报,2007,22（3）:203-206.

［4］温周瑞,刘慧集,骆敏,等.中草药对水产动物免疫作用研究进展［J］.水利渔业,2004,24（2）:1-3.

［5］金珊,王国良,赵青松,等.中草药对海水养殖鲈鱼病原菌的抑菌效果研究［J］.海洋科学,1999（5）:8-10.

［6］李茜,张懿瑾,华汝泉,等.23种中草药及复方对鲫肠道3种细菌的体外抑菌试验［J］.淡水渔业,2007,37（4）:7-11.

［7］陶健,李绍戊,刘红柏.21种中草药及复方制剂对嗜水气单胞菌的体外抑菌作用［J］.水生态学杂志,2013,34（3）:90-93.

［8］陈霞,张其中,李春涛.47种中草药体外抑杀嗜水气单胞菌的药效研究［J］.水产科学,2012,31（7）:387-391.

［9］李义奎,王钦茂.中药药理实验方法学［M］.上海:上海科学技术出版社,1991:286-292.

［10］戴自英.临床抗菌药物学［M］.北京:人民卫生出版社,1985:20-22.

［11］ Khan A M,Faruque A S G,Hossain M S,et al.Plesiomonasshigelloides-associateddiarrhoeainBangladeshi children:a hospital-based surveillance study［J］.Journal ofTropical Pediatrics,2004,50（6）:354-356.

［12］Ozdemir O,Sari S,Terzioglu S,et al.Plesiomonas shigelloides sepsis and meningoencephalitis in a surviving neonate［J］.Journal of Microbiology,Immunology and Infection,2010,43（4）:344-346.

［13］潘璠,方苹,陈辉.罗氏沼虾几种病原菌防治药物的筛选［J］.水产养殖,2007,28（6）:39-41.

［14］陈林,谭爱萍,邹为民.斑点叉尾致病菌株的鉴定及特性［J］.大连水产学院学报,2009,24（3）:200-205.

［15］胡钱东,林强,石存斌,等.草鱼致病性类志贺邻单胞菌的分离与鉴定［J］.微生物学报,2014,54（1）:229-235.

［16］张新艳,樊海平,曾占壮.草鱼致病性类志贺邻单胞菌的分子鉴定及快速检测［J］.福建农业学报,2013,28（7）:634-638.

［17］周宇,周秋白.嗜水气单胞菌防控技术研究进展［J］.生物灾害科学,2012,35（1）:126-133,141.

［18］王友娟,李荣峰,李华,等.辽宁地区养殖淡水鱼感染嗜水气单胞菌的流行病学调查［J］.中国农业科技导报,2012,14（4）:128-134.

［19］杨永仙.抗生素和中草药在水产养殖疾病防治中的作用［J］.云南农业,2008（6）:17.

［20］汪黎虹,关瑞章,李忠琴,等.10种单味中药对养殖鳗鲡主要致病菌的抑制作用［J］.集美大学学报:自然科学版,2010,15（6）:1-5.

［21］张海宾,杨桂芳.12种中草药对嗜水气单胞菌杀伤能力的研究［J］.水产科学,2006,25（1）:16-18.

［22］喻鹏飞,赵丽娟,董玲燕,等.姜黄提取物对水产动物病原菌的抑制作用［J］.安徽农业科学,2016,44（11）:148-150.

［23］张文青,龚一富,金思,等.中草药及其配伍对嗜水气单胞菌的抑菌作用［J］.渔业科学进展,2012,33（1）:114-121.

［24］赖晓健,杨方园,李忠琴.太平洋双色鳗鲡（Anguilla bicolor pacifica）致病性类志贺邻单胞菌的鉴定和中药敏感性研究［J］.海洋与湖沼,2016,47（6）:1185-1192．