口腔、口咽鳞状细胞癌中HPV感染与EGFR之间的相关性研究*

李俏丽，李超，王薇，蔡永聪，孙荣昊，周雨秋，税春燕, 黄璐，覃纲

646000 四川泸州, 西南医科大学临床医学院(李俏丽、李超、税春燕、覃纲)；610041成都，四川省肿瘤医院·研究所，四川省癌症防治中心,电子科技大学医学院 头颈外科(李俏丽、李超、王薇、蔡永聪、孙荣昊)；610083成都，成都医学院(周雨秋、黄璐)

HPV是头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，SCCHN)致病因素之一，HPV感染与烟酒诱因导致的SCCHN在生物学行为上不同，其阳性感染的SCCHN对放化疗敏感，预后较好[1]。在欧美国家，HPV感染的SCCHN逐年增加，特别是口腔鳞癌和口咽鳞癌[2]，因此得到了广泛学者的关注。有研究报道，P16蛋白在HPV感染有关的癌或者癌前病变中过表达，是一种检测HPV感染的可靠指标[3]，所以许多学者通过检测P16蛋白的表达来分析HPV的感染情况。EGFR是目前发现的一种表皮生长因子受体，其在SCCHN中表达率最高可达100%，早期有文献报道，HPV E6/E7可能通过刺激血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)上调EGFR的表达[4],但也有其他研究认为两者呈负相关[5]，所以HPV感染与EGFR的表达关系尚不明确。此外，尽管口腔、口咽在解剖区域相邻，但HPV阳性感染却有所差异[6-7]，因此本文采用免疫组化法检测HPV相关指标P16和EGFR在口腔、口咽鳞癌中的表达情况及分析其临床资料，为其诊断及分子靶向治疗提供一定参考依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集2014年1月至2017年6月四川省肿瘤医院病理科存档完整的活检或手术切除标本蜡块88例。其中口腔鳞癌53例、口咽鳞癌35例，年龄26～81岁，中位年龄60.5岁。所有肿瘤患者根据美国癌症联合委员会和国际抗癌联盟联合制订的2002年临床分期标准进行分期，其中I～Ⅱ期33例、Ⅲ～Ⅳ期55例。分化程度：高分化43例，中分化30例，低分化15例。颈淋巴结转移44例，复发35例。单纯手术：25例，其中15例为T1～2，N0～1。手术联合术后放化疗：37例患者行根治、扩大或部分切除术，手术缺损多用游离前臂皮瓣、股前外侧皮瓣等修复，术中冰冻病理检查示：切缘均阴性。颈部淋巴结转移患者行根治性或选择性颈清扫。术后行调强放疗，剂量为50～66Gy，平均60Gy，同步2～4周期化疗。调强放化疗：26例根治剂量60～70Gy，平均64Gy,同步化疗方案均使用顺铂30mg/m2，1次/周，共5～7次。

1.2 方法与试剂

所有样本均经甲醛固定，常规石蜡包埋，4μm连续切片。采用免疫组织化学二抗-酶标多聚体(Envision)二步法，其中一抗修复采用高压修复法，P16稀释浓度为1:200，EGFR稀释浓度为1:100。用磷酸缓冲液代替一抗做阴性对照，已知P16阳性表达的宫颈组织及EGFR阳性表达的食管鳞癌切片为阳性对照。具体步骤参考试剂说明书。鼠抗人P16INK4a蛋白单克隆抗体和鼠抗人EGFR单克隆抗体均购自北京中杉金桥公司。

1.3 结果判定

P16阳性着色定位于细胞核和细胞质，而EGFR阳性着色定位于细胞质和细胞膜，染色均呈棕黄或棕褐色。两位病理专家用双盲法独立阅片，具体操作如下：随机选取5个高倍镜，每个高倍镜中选取100个相邻细胞，计算阳性细胞百分比与着色强度。(1)阳性细胞数 ≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；(2)着色强度即多数阳性细胞所呈现的颜色强度，无色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。将(1)(2)两者积分相乘，0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为阳性(++),9～12分为强阳性(+++)，若两位病理专家结果相差3分则重新判定。

1.4 统计学方法

采用SPSS 24.0 统计软件进行分析。计量资料采用t检验,计数资料采用χ2检验或确切概率法。相关分析采用分类变量的关联性分析，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 P16和EGFR在口腔、口咽鳞癌中的表达

88例患者中P16阳性表达36例，其中口腔12例，口咽24例，阳性率分别为22.6%(12/53)、68.6%(24/35)。88例患者中EGFR阳性表达61例，其中口腔30例，口咽31例，阳性率分别为56.6%(30/53)、88.6%(31/35)。(图1、表1、表2)

图1 P16、EGFR在口腔、口咽鳞癌中的免疫组化表达(10×10)A:阴性对照；B：P16阳性;C:EGFR阳性Fig 1 Expression of P16 and EGFR in oral, oropharyngeal squamous carcinomaA：Control; B:P16 expression; C:EGFR expression

分组例数P16阳性阴性χ2P口腔5312(22.6%)41(77.4%)口咽3524(68.6%)11(31.4%)18.396<0.001

表2 EGFR在口腔、口咽鳞癌中的表达情况Table 2 Expression of EGFR in oral andoropharyngeal squamous carcinoma

2.2 P16和EGFR表达在口腔、口咽鳞癌中相关性

P16总阳性表达率为40.9%，EGFR为69.3%，P16与EGFR在口腔、口咽鳞癌中具有正相关性(P<0.001，χ2=14.77，r=0.379)，其中在口腔鳞癌中P16与EGFR呈正相关性(P=0.001，χ2=10.32，r=0.817)，而在口咽鳞癌中两者未具有相关性(P>0.05)(见表3)。

表3 P16与EGFR在口腔、口咽鳞癌的相关性Table 3 Correlation of P16 and EGFR in oral andoropharyngeal squamous carcinoma

2.3 P16和EGFR表达在口腔、口咽鳞癌中的临床病理特征关系

P16阳性组和阴性组相比，在性别、吸烟、肿瘤分化程度高和复发病例数低方面，有显著的统计学差异。(80.6%vs.19.4%,P=0.038;66.7%vs.33.3%,P=0.038;69.4%vs.30.6%,P=0.004;75.0%vs.25%,P=0.018)。但在是否饮酒、T分期、N分期、临床分期、年龄上均相近(P=0.119、0.648、0.600、0.263、0.524)。此外,EGFR阳性组和阴性组在患者性别情况上比较，差异有统计学意义(P<0.05)(见表4)。

表4 P16、EGFR表达与口腔、口咽鳞癌患者临床病理特征的关系(例)Table 4 Expression of P16 and EGFR related to theclinicopathological characteristics of oral andoropharyngeal squamous carcinoma

3 讨 论

在欧美国家，SCCHN的发病率明显上升，流行病学和分子生物学证据表明，SCCHN的发病趋势与HPV感染密切相关[8]。HPV阳性与阴性的SCCHN在致病因素、病理学特征、患者性别、行为方式等方面有很大的区别。有调查显示,HPV感染的口腔、口咽鳞癌的发病率逐年递增[2]，以往普遍认为，吸烟和饮酒是其中的重要原因，但随后有研究报道15%～20%的口腔、口咽鳞癌患者不吸烟，而这些患者通常具有年纪轻、有不洁性交史和伴有HPV感染的特点[9]。因此，越来越多的学者开始关注HPV感染与头颈鳞癌之间的相关性。随着研究的进展，目前在最新发布的第八版美国联合委员会癌症(AJCC)分期手册中已将HPV感染作为口咽鳞癌分期的独立因素[10]。HPV的致癌机制是通过其E6、E7基因整合到宿主细胞里，从而促使宿主细胞周期蛋白增殖。E6基因编码蛋白可以与P53结合并使其降解，细胞周期由G1期向S期转化，促进细胞内DNA的合成与复制，从而导致细胞异常增殖。E7基因编码蛋白结合Rb，引起E2F的释放和P16蛋白过表达，致使细胞生长失控[11]。目前检测HPV感染方式很多，方法各有优劣，有不少研究报道P16蛋白与HPV感染具有一定的一致性[12-13]，因此本文采用免疫组化法检测P16蛋白的表达来进一步分析HPV感染的情况。另外，在SCCHN中EGFR呈现高表达，约51%～100%。它是表皮生长因子受体(HER)家族的一种，可促进组织细胞分裂，其过度表达可致癌。基于此，现已有针对EGFR的靶向药进入临床试验阶段[14]。在SCCHN中HPV的高感染率与EGFR的高表达率似乎存在一定联系，不少学者开展了相关研究，但其关系仍尚不清楚。

本研究对P16、EGFR阳性表达检测中发现(表1、表2)，口咽鳞癌中P16阳性率远高于口腔鳞癌(68.6%vs. 22.6%,P=0.000),说明口咽鳞癌与HPV感染关系更密切，AJCC分期手册中也将P16蛋白作为HPV感染代替标志物，建立了一个人乳头状病毒相关口咽癌(high-risk human papilloma virus associated oropharyngeal cancer，HR-HPV OPC) 的独立分期[10]。尽管口腔与口咽在解剖结构上相邻、镜下组织细胞结构并没有明显差异，但HPV感染、P16蛋白的表达却存在差异，这需要进一步深入研究。此外，HPV感染是口腔鳞癌的致病因素之一，这一观点仍然存在争议，有学者报道，除口咽鳞癌以外，SCCHN中很少与HPV感染相关[15]。但也有研究报道，口腔鳞癌中，HPV感染具有显著的相关性[13]。由于争议的存在，所以这次更新的AJCC分期手册中，口腔癌的分期未有重大改革。另外，本研究中，口咽鳞癌中的EGFR阳性表达高于口腔鳞癌(88.6%vs.56.7%)，与现有报道一致[14]。

研究中对口腔、口咽鳞癌的临床病理资料进行统计后发现，P16阳性的患者，其在性别、吸烟情况、肿瘤分化程度和复发情况方面，有显著的统计学差异(P<0.05)，P16阳性患者往往具有性别为男性、无吸烟史、肿瘤分化程度中-低、复发率低的特点。然而在是否饮酒、T分期、N分期、临床分期、年龄上无差异(P>0.05)。有文献报道，HPV感染在性别上具有差异，男性患病率增长更显著，逐渐成为主要趋势[16]。同时，也有些研究显示，HPV感染、P16蛋白表达在女性患者较多，或者在性别上并没有明显差异[5,17]。现阶段不同的报道存在一定差别。本研究入组患者男性比例高，可能存在一定的选择偏椅。P16阳性组的吸烟患者数量低于阴性组，并存在统计学差异，说明HPV感染的患者多数未有吸烟史，此结果与目前文献报道一致[17]。另外有文献报告，P16阴性组多为高分化，且多为Ⅰ～Ⅱ期患者[17-19]。也有研究在分化程度上与之结果相反，P16表达与分化程度呈正相关，即P16表达阳性的患者，其分化程度多为高分化[20]。本研究中P16阳性组的分化程度多为中低分化，且不易复发(P<0.05)，T、N、临床分期、淋巴结转移个数没有明显统计学意义，但具有T1+T2患者比例大于T3+T4期的趋势(52.8%vs.47.2%)。此外，本研究中EGFR表达与T分期无关，该结果与 Leong等[21]的研究结论不一致，其原因可能是因样本量不够或样本来源比例不同而导致的误差。EGFR表达与性别有关，未见文献报道。此研究也显示P16与EGFR在口腔、口咽鳞癌中具有正相关性(P<0.001，χ2=14.77，r=0.379)，HPV感染与EGFR表达有关，这与Mathur等[4]的研究结果一致。在口腔、口咽鳞癌分层分析中，口腔鳞癌中的P16与EGFR之间具有正相关性(P=0.001，χ2=10.32，r=0.817)，而口咽鳞癌却未存在相关性。此原因可能是口咽鳞癌的样本量不足。目前关于研究P16与EGFR相关性的文献报道存在争议[4-5,22]，其具体机制也尚不清楚，因此需要扩大样本量进一步明确机制。

近些年来，HPV感染在宫颈、口咽鳞癌的机制已经基本明确，但在口腔鳞癌中的机制尚不明了[23]。本研究发现P16与EGFR在口腔、口咽鳞癌的表达上具有差异，这有可能是两者致癌机制不同的原因。另外，口腔、口咽鳞癌中P16表达与肿瘤复发、分化程度、患者性别和吸烟情况有关，P16可作为独立预后指标，同时，P16与EGFR表达具有正相关性，联合检测可提高对肿瘤的评估，也为今后的联合靶向治疗提供了理论依据。

作者声明：本文第一作者对于研究和撰写的论文出现的不端行为承担相应责任；

利益冲突：本文全部作者均认同文章无相关利益冲突；

学术不端：本文在初审、返修及出版前均通过中国知网(CNKI)科技期刊学术不端文献检测系统学术不端检测；

同行评议：经同行专家双盲外审，达到刊发要求。

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