不同加工方式亳白芍的高效液相指纹图谱及多成分含量比较

梁德勤，赵园园，罗 云，金传山，吴德玲，张 伟，王 林，凌 伟

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012； 2.安徽协和成药业饮片有限公司，安徽 亳州 236800)

白芍为毛茛科植物芍药(PaeonialactifloraPalL.)的根，主产于安徽、四川、浙江及山东菏泽，其中以安徽省亳州市产量最大，市场占有率最高。产于亳州的白芍又习称“亳白芍”。据了解，现亳白芍的种植面积达133 km2，并有进一步扩大的趋势。目前，亳白芍饮片的加工与炮制主要遵循2015年版《中华人民共和国药典》以及2005年版《安徽省中药饮片炮制规范》有关要求进行，即将鲜白芍置沸水中煮后除去外皮，晒干为白芍药材；再将白芍药材通过软化、切片和干燥等环节形成白芍饮片[1-2]。由于白芍药材较难干燥，如遇阴雨天气，未完全干燥的药材易发黏，药农不得已使用硫熏的方法来防止白芍发黏变色，从而导致白芍中芍药苷含量下降，二氧化硫残留量超标，影响白芍质量[3]。此外，将白芍药材切制为饮片需要长时间浸泡、润制等软化环节导致有效成分流失严重[4]。近年来，有企业采用产地加工与炮制一体化的加工方式，在产地将白芍鲜药直接加工为白芍片，缩短了加工时间，且减少了有效成分芍药苷的流失。对于亳白芍产地加工与炮制一体化加工技术参数已有较多报道，而采用产地加工与炮制一体化的加工方式形成趁鲜片与传统片标准煎液指纹图谱和多指标成分的分析未见报道。

本研究主要以亳白芍不同加工方式饮片标准煎液为研究对象，以高效液相色谱法建立不同加工方式亳白芍饮片标准煎液的指纹图谱，并以指纹图谱共有峰相对峰面积对所有样品进行聚类分析；同时对亳白芍不同加工品标准煎液中没食子酸等7种成分含量进行测定，以更加全面地评价亳白芍传统切制、煮后趁鲜切制以及鲜品直接切制3种不同加工方式对其饮片质量的影响，为亳白芍产地加工与炮制一体化应用的可行性提供科学依据。

1 仪器与材料

Agilent 1260高效液相色谱仪：美国Agilent公司；岛津ATY224-电子天平：日本Shimadzu；赛多利斯Sartorius百万分之一电子天平：德国Sartorius公司；津腾GM-0.5A隔膜真空泵：天津市津腾实验设备有限公司；科恒DL-1电子万用电炉：上海科恒实业发展有限公司。

没食子酸对照品(批号YAO505YA14，纯度≥98%)、氧化芍药苷对照品(批号Y31D5J1，纯度≥98%)、芍药内酯苷对照品(批号Z16M6B1，纯度≥91.4%)、芍药苷对照品(批号X27F8C30162，纯度≥98%)、苯甲酸对照品(批号TS0911CA14，纯度≥98%)、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖对照品(批号P29F7F10218，纯度≥99%)、苯甲酰芍药苷对照品(批号P02D7F26004，纯度≥98%)：均购自上海源叶生物科技有限公司；乙腈为色谱纯；水为娃哈哈纯净水；其他试剂均为分析纯。

白芍采自安徽省亳州市周边乡镇，采集信息见表1，所有采集的白芍新鲜根部均经安徽中医药大学药学院金传山教授鉴定为毛茛科植物芍药(PaeonialactifloraPalL.)的根。

表1 亳白芍样品采集信息表

注：①BS1-BS9采自安徽省亳州市谯城区；②BS10虽采自毗邻亳州市的河南省，但为亳白芍种质

10批白芍鲜品均在安徽协和成药业饮片有限公司按照前期研究确定的工艺分别进行饮片加工。

白芍传统片A1—A10：鲜白芍煮后，滚筒去皮机去皮，低温烘干，即得白芍药材；再将白芍药材浸泡、润制等软化至适宜程度，置切药机上切2～3 mm圆片，低温烘干，得样品A1-A10。

白芍趁鲜片B1-B10：鲜白芍煮后，滚筒去皮机去皮，低温烘干至适宜程度，置切药机上切2～3 mm圆片，低温烘干，得样品B1-B10。

白芍生斜片C1-C10：鲜白芍滚筒去皮机去皮，置切药机上切2～3 mm斜片，低温烘干。得样品C1-C10。白芍生斜片近年大量出口至韩国及中国台湾，在中国大陆鲜少应用，因此本研究拟对其质量进行研究。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 分别精密称取对照品没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖和苯甲酰芍药苷适量于25 mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容，即得混合对照品溶液，用于指认指纹图谱共有峰。

2.1.2 标准煎液供试品溶液的制备 精密称取白芍饮片20 g于圆底烧瓶中，加入7倍量水，浸泡30 min，煎煮60 min，过滤，收集滤液，滤渣再用6倍量水煎煮40 min，合并两次滤液，浓缩后转移，并以水定容至100 mL容量瓶作为储备液备用。精密移取储备液1 mL于10 mL容量瓶中，以甲醇稀释至刻度，摇匀后静置20 min，分出上清液，以0.45 μm有机滤头滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.2 色谱条件 美国Waters Symmetry ShieldTMRP18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)。二元梯度洗脱程序：0～20 min，5%→20% B；20～30 min，20%→25% B；30～45 min，25%→30% B；45～55 min，30%→35% B。柱温为25 ℃，容积流量为1.0 mL/min，进样量为10 μL。检测波长：0～8 min，274 nm；8～14 min，214 nm；14～18 min，257 nm；18～20.5 min，232 nm；20.5～28 min，220 nm；28～34 min，228 nm；34～38 min，217 nm；38～55 min，229 nm。各成分最大吸收波长分别以全波长扫描确定，芍药苷在最大吸收波长处色谱峰过高，影响其余小峰的观察，因此未采用最大吸收波长。检测时间为55 min。

2.3 方法学考察

2.3.1 标准曲线的建立 依照各点均匀分布在标准曲线上的原则，计算好最低浓度与最高浓度后，等间距配制或稀释中间3个浓度，将各对照品配制后，分别进样10 μL，按照“2.2”项下色谱条件进行测定，以峰面积为纵坐标，对照品浓度(mg/mL)为横坐标进行线性回归，建立各成分的标准曲线，线性方程、相关系数及线性范围见表2。

2.3.2 精密度试验 取样品A6，按“2.1.2”项下供试液制备方法制备供试液，连续进样6次，以芍药苷为参照峰，测得各色谱峰相对保留时间RSD均小于0.07%，各色谱峰相对峰面积RSD均小于0.3%，证明白芍指纹图谱及多成分分析方法精密度良好。

2.3.3 重复性试验 取样品A6，按“2.1.2”项下供试液制备方法平行制备6组供试液，分别进样，以芍药苷为参照峰，测得各色谱峰相对保留时间RSD均小于0.3%，各色谱峰相对峰面积RSD均小于1.0%，证明白芍指纹图谱及多成分测定方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 取样品A6，按“2.1.2”项下供试液制备方法制备供试液，在室温放置0、2、4、8、12、24、48 h后分别进样，以芍药苷为参照峰，测得27个共有峰的相对保留时间RSD均小于0.1%，各色谱峰相对峰面积RSD均小于0.1%，表明供试液在48 h内稳定性较好。

表2 7种成分线性方程、相关系数及线性范围

2.3.5 加样回收率试验 取同一已知含量白芍样品6份，每份5 g，精密称定，分别精密加入7种对照品适量，按“2.1.2”项下供试液制备方法制备供试液(等比例缩小一倍)，并进样测定，结果7个化合物的平均加样回收率分别为99.00%、101.80%、100.77%、98.86%、99.58%、98.76%、98.47%，RSD均小于3%，表明建立的标准煎液定量方法准确性良好。

2.4 不同加工方法亳白芍标准煎液指纹图谱 将10批亳白芍传统片(A1—A10)高效液相色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版)》(2010国家药典委员会)，以A1为参照图谱，时间窗设为1.0，多点校正，自动匹配后以中位数法生成对照图谱，标记为A0，匹配图谱见图1，10批传统片相对于A0的相似度见表3。后将10批亳白芍趁鲜片(B1—B10)及A0导入相似度评价系统，并以A0为参照图谱，多点校正，自动匹配，匹配图谱见图2，并记录B1—B10共10批样品标准煎液相对于A0的相似度，见表3。白芍生斜片(C1—C10)图谱处理同亳白芍趁鲜片，匹配图谱见图3，10批样品相对于A0的相似度见表3。

3种亳白芍饮片各自10批样品的对照图谱(B1—B10的对照图谱为B0，C1—C10的对照图谱为C0)及混合对照液高效液相色谱图见图4，30批白芍样品共有峰为23个，其中由对照品指认7个，分别为3号峰(没食子酸)、7号峰(氧化芍药苷)、10号峰(芍药内酯苷)、11号峰(芍药苷)、20号峰(苯甲酸)、21号峰(1,2,3,4,6-O-没食子酰葡萄糖)和22号峰(苯甲酰芍药苷)。亳白芍传统片与亳白芍趁鲜片的高效液相色谱图共有峰数量及大小相当，而生斜片在芍药内酯苷(7号峰)与芍药苷(10号峰)之间出现了一个小峰，其余峰的数量与传统片相当，部分峰的大小与亳白芍传统片有差异。

对3种亳白芍饮片的指纹图谱相似度进行单因素方差分析，结果显示，亳白芍传统片和亳白芍趁鲜片指纹图谱相似度均明显高于亳白芍生斜片(P<0.05)，而亳白芍传统片和亳白芍趁鲜片指纹图谱相似度比较，差异无统计学意义(P>0.05)。因此，亳白芍趁鲜片与亳白芍传统片内在质量相似度较高，而生斜片略低。

注：从下至上依次是A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、A0的图谱

图1亳白芍传统片(A1—A10)标准煎液高效液相色谱匹配图及其对照品(A0)图谱

注：从下至上依次是B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9、B10、A0的图谱

图2亳白芍趁鲜片(B1—B10)标准煎液高效液相色谱匹配图及其对照品(A0)图谱

注：从下至上依次是C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、A0的图谱

图3亳白芍生斜片(C1—C10)标准煎液高效液相色谱匹配图及其对照品(A0)图谱

注：3.没食子酸；7.氧化芍药苷；10.芍药内酯苷；11.芍药苷；20.苯甲酸；21. 1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖；22.苯甲酰芍药苷

图4 3种加工方式亳白芍饮片高效液相指纹图谱

注：与亳白芍生斜片比较，*P<0.05

对30批亳白芍样品的共有峰相对峰面积以组间联接平方欧氏距离法进行聚类，聚类分析结果见图5。结果显示，亳白芍趁鲜片与传统片聚为一类，亳白芍生斜片聚为一类，与相似度对比结果一致。

图5 不同加工方式亳白芍饮片标准煎液聚类分析树状图

2.5 亳白芍标准煎液中7种成分含量测定 取3种不同加工方式亳白芍饮片20 g，精密称定，按“2.1.2”项下方法制备标准煎液供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样10 μL进行测定，以标准曲线法计算样品中7种指标性成分含量，结果见表4。单因素方差分析结果表明，3种亳白芍饮片中氧化芍药苷和芍药内酯苷含量比较，差异无统计学意义(P>0.05)；亳白芍趁鲜片中芍药苷与没食子酸含量均明显高于传统片和生斜片(P<0.05)；3种亳白芍饮片中苯甲酸含量比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，亳白芍生斜片中苯甲酸含量最高，亳白芍传统片中苯甲酸含量最低；亳白芍生斜片中1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖及苯甲酰芍药苷含量均明显低于传统片及趁鲜片(P<0.05)。结果提示，亳白芍趁鲜片中7种成分与亳白芍传统片中7种成分含量差异较小，而白芍生斜片中各成分含量与传统片差异较大，此结果与指纹图谱及聚类分析结果一致。

3 讨论

对于白芍的研究大多集中在醇提液，极少对直接应用于临床的标准煎液进行研究，本研究选用标准煎液进行研究，标准煎液的制备参考中药饮片标准汤剂研究策略中标准汤剂的制备方法，使用玻璃器皿提取，提取过程使用冷凝设备进行回流，提高提取效率[8]。且本研究将指纹图谱与含量测定相结合，既对其中的主要成分进行定量，又兼顾中药发挥药效的整体性，更能准确评价白芍质量。

表4 不同加工方式亳白芍标准煎液7种成分含量

注：与亳白芍传统片比较，*P<0.05；与亳白芍趁鲜片比较，#P<0.05

亳白芍生斜片中除被视为无效成分甚至有害成分的苯甲酸较高外，其余6种成分含量均低于白芍传统片，说明煮制可升高白芍中多种成分含量，同时又可降低白芍中苯甲酸含量[9-10]。在海外广泛应用的亳白芍生斜片的药效及其药效基础尚不甚清晰，其能否同白芍传统片一并应用于临床尚需进一步研究。

在白芍主产地推广产地加工与炮制一体化加工模式，将分散无序的药农或作坊式加工模式转变为统一在企业进行加工，使白芍加工更加规范，有利于提高白芍饮片质量[11]。从指纹图谱和多种成分含量的比较来看，亳白芍趁鲜片质量并不低于亳白芍传统片，但相关规定中暂未将其趁鲜加工合法化，阻碍了趁鲜加工及产地加工与炮制一体化技术的发展。

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