当归芍药散含药血清抑制内皮素-1介导的肝星状细胞收缩的机制研究

刘浩坤，潘永福，周 敏，王运来，尹丹丹，许 钒

(安徽中医药大学，安徽 合肥 230012)

肝硬化腹水是诸多肝脏疾病的常见并发症，是由肝功能减退、门静脉高压导致肝脾肿大，机体无法吸收蛋白质和维生素而在体液中形成高渗环境，导致腹腔积水增多引起的恶性疾病。该病主要临床表现为腹胀、腹壁静脉曲张、食管胃底静脉曲张等，其中肝门静脉高压在肝硬化腹水的形成中起主导作用[1]。肝门静脉高压的形成系肝内血流阻力以及门静脉血流量增加所导致的。研究表明，肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)参与肝纤维化细胞外基质和肝脏微循环调节，其中RhoA/ROCK信号通路能够活化HSCs[2-5]，而活化后的HSCs在肝门静脉高压形成过程中起重要作用[6-7]。研究发现，RhoA/ROCK通路激活后，可使肝内血管阻力增大，抑制内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)的活性，刺激HSCs收缩，加速肝硬化静脉高压的形成[8-9]。

当归芍药散(Danggui Shaoyao San，DSS)出自张仲景《金匮要略》，由当归、芍药、川芎、白术、茯苓、泽泻6味药组成，具有活血利水之功效。研究表明，DSS可通过保护肝细胞、抗肝损伤作用而改善门静脉循环障碍、增强免疫功能和促进利尿等[10-12]。本研究拟考察DSS含药血清对内皮素-1(endothelin，ET-1)介导的HSCs中RhoA/ROCK Ⅱ和eNOS蛋白表达的影响，探讨其机制，为该药治疗肝硬化腹水提供实验依据。

1 材料

1.1 药材 DSS组方药材购于安徽协和成药业饮片有限公司，并经安徽中医药大学药学院金传山教授鉴定，均符合《中华人民共和国药典》(2015年版)项下标准。参照原方比例(当归3 g，芍药16 g，川芎8 g，白术、茯苓各4 g，泽泻8 g)称取药材，醇提浓缩制备所含生药浓度为1.72 g/mL的DSS提取液。

1.2 细胞株及动物 大鼠HSC-T6细胞株购自江苏凯基生物技术股份有限公司。该细胞株系SV40转染SD大鼠HSCs而成，表型为活化的HSCs。健康雄性SD大鼠，200～220 g，购自安徽省实验动物中心，生产许可证号为SCXK(皖)2011-002。

1.3 主要试剂 高糖培养基：Hyclone公司；胰酶消化液：碧云天生物技术研究所；磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)：北京中杉生物技术有限公司；Y27632(ROCK抑制剂)：上海前尘生物科技有限公司；脱脂奶粉：上海光明乳品有限公司；电化学发光试剂盒：Thermo公司；BCA(bicinchoninic acid)蛋白浓度测定试剂盒：碧云天生物技术研究所；十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、四甲基乙二胺(N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine,TEMED)：Sigma；NaCl：上海苏懿化学试剂有限公司；甘氨酸：Solarbio；PVDF膜：Millipore公司；预染蛋白Marker：Thermo；过硫酸胺、丙烯酰胺：sigma；RhoA(兔多抗)、ROCK Ⅱ(兔多抗)：Abcam公司；eNOS(兔多抗)：Santa cruz。

1.4 主要仪器 灭菌锅：日本Tomy KOQYO公司；多功能酶标仪：美国MD公司；超净工作台(YJ-1450)：苏净集团安泰公司；干燥箱：上海一恒科技有限公司；细胞培养箱：日本Sanyo公司；AF-10型自动制冰机：意大利SCOTSMAN；VE-186型转膜仪、VE-180电泳槽、EPS300型电泳仪：Tanon；X胶片：Kodak；TS-1000水平摇床：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；纯水机：美国SIM。

2 方法

2.1 含药血清的制备 取20只健康雄性SD大鼠，适应性饲养1周后随机分为两组：空白组和给药组。给药组以10 mL/kg给药剂量每日灌胃DSS提取液2次(早晚各1次)，连续3 d；空白组给予等剂量的生理盐水。末次给药1 h后，腹腔注射3.5%水合氯醛(10 mL/kg)麻醉，于无菌状态下腹主动脉采血，37 ℃静置1 h后，3 500 r/min离心10 min，将相同条件下所采血清混和，56 ℃、30 min灭活，以除去可能存在的生物活性物质，再用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，密封后置于-20 ℃冰箱保存备用。同时以生理盐水制备的正常大鼠血清作对照。将冷冻保存于液氮中的HSCs复苏后接种于DMEM培养基(含10%胎牛血清、链霉素100 U/mL和青霉素100 U/mL)，37 ℃、50 mL/L CO2条件下培养。当细胞呈单层致密状时，2.5 g/mL胰蛋白酶消化后传代。

2.2 实验分组 实验均在呈指数生长的细胞中进行。空白组：无血清DMEM培养基+空白大鼠血清(终浓度为10%)；模型组：无血清DMEM培养基+空白大鼠血清(终浓度为10%)+ET-1(终浓度为10 nmol/L)；DSS含药血清低剂量组：无血清DMEM培养基+DSS含药血清(终浓度为5%)+ET-1(终浓度为10 nmol/L)；DSS含药血清中剂量组：无血清DMEM培养基+DSS含药血清(终浓度为10%)+ET-1(终浓度为10 nmol/L)；DSS含药血清高剂量组：无血清DMEM培养基+DSS含药血清(终浓度为15%)+ET-1(终浓度为10 nmol/L)；Y-27632抑制剂组：无血清DMEM培养基+Y-27632(终浓度为100 μmol/L)+ET-1(终浓度为10 nmol/L)。

2.3 Western blot法检测 将上述分组的细胞处理后每瓶加含有苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)(100 mmol/L)的裂解液约400 μL，冰浴下充分裂解细胞，细胞裂解液于4 ℃、12 000 r/min条件下离心5 min，将离心后的上清液分装转入1.5 mL的离心管中于-20 ℃保存。用考马斯亮蓝G250染色测定蛋白浓度后，以每孔含25 μg蛋白的溶液为上样量，SDS-PAGE凝胶(12%分离胶、5%浓缩胶)电泳(120 V/60 V)，转膜至硝酸纤维素膜(NC膜)，5%脱脂奶粉于室温下脱色摇床上摇动封闭4 h，封闭后加入一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，PBST(PBS+吐温-20)洗膜3遍，加入辣根过氧化物酶标记的二抗稀释液(1∶50 000)室温孵育2～3 h后，洗膜，化学发光法显影。将照片进行扫描或拍照，将目的条带的分子量和净光密度值用Bio-Rad凝胶图像处理系统分析。

3 结果

3.1 DSS含药血清对ET-1诱导的HSC-T6细胞内RhoA、ROCKⅡ蛋白表达的影响 与空白组比较，模型组细胞内RhoA、ROCKⅡ蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。与模型组比较，DSS含药血清高、中、低剂量组及Y-27632抑制剂组均可显著下调RhoA蛋白表达(P<0.05)，DSS含药血清高、中、低剂量组可不同程度下调ROCK Ⅱ蛋白表达，其中高、中剂量组显著下调ROCKⅡ蛋白的表达(P<0.05)；Y-27632抑制剂组可显著抑制下调RhoA、ROCK Ⅱ蛋白的表达(P<0.05)。见图1。

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；A.空白组；B.模型组；C.DSS含药血清低剂量组；D.DSS含药血清中剂量组；E.DSS含药血清高剂量组；F.Y-27632抑制剂组

3.2 DSS含药血清对ET-1诱导的HSC-T6细胞内eNOS蛋白表达的影响 与空白组比较，模型组细胞内eNOS蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；与模型组比较，DSS含药血清高、中、低剂量组均可上调eNOS蛋白表达水平，且呈现一定剂量依赖性，其中高、中剂量组上调eNOS表达作用显著(P<0.05)。见图2。

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；A.空白组；B.模型组；C.DSS含药血清低剂量组；D. DSS含药血清中剂量组；E.DSS含药血清高剂量组

4 讨论

HSCs具有收缩或舒张功能，在肝脏的微循环以及门静脉高压的调节过程有着非常重要的作用。ET是目前已知的缩血管活性最强的多肽物质，参与门静脉高压的形成[13]，而ET-1可促进HSCs活化、增殖和收缩，是肝硬化进程中的重要参与者，故本实验采用ET-1为DSS含药血清的调控对象。课题组前期研究发现，不同剂量的DSS含药血清能够有效抑制HSCs细胞肌动蛋白丝数量增多，同时可以不同程度地抑制ET-1引起的HSCs细胞胶原凝胶收缩[14]。故本实验在此基础上考察DSS含药血清对ET-1诱导的HSCs细胞收缩的机制。

ET-1刺激引起的HSCs收缩不依赖钙通道，其主要由Rho相关激酶信号途径介导，在此途径中RhoA/ROCK通路对HSCs收缩的调控机制是近年研究的热点。Rho蛋白是许多膜表面受体的下游效应蛋白，在细胞的信号转导通路中作为信号转换器或分子开关，作用于细胞骨架或其靶蛋白而产生多种生物效应，在细胞形态学、细胞骨架功能、分泌和细胞收缩中均发挥作用[15]，RhoA是其中的一种，它参与调节肌动蛋白应力纤维的装配，RhoA相关激酶ROCKⅠ、ROCK Ⅱ是其下游效应分子，接受RhoA传递的活化信号[16-17]。如果阻断RhoA/ROCK信号通路，HSCs的活化、分泌、收缩等均会受到影响。ROCK抑制剂Y-27632是一类人工合成的吡啶类复合物，通常其以载体介导的方式被细胞摄取，在细胞内结合到Rho蛋白下游效应器Rho激酶的催化位点，从而抑制激酶活性[18]。本实验中，模型组细胞内RhoA、ROCK Ⅱ蛋白表达水平较空白组均显著升高，DSS含药血清各剂量组较模型组均可不同程度下调RhoA、ROCKⅡ蛋白表达。实验结果显示，DSS含药血清可通过抑制RhoA/ROCK通路来抑制HSC-T6细胞收缩。

eNOS广泛存在于人体内皮细胞、心肌细胞、肥大细胞及血细胞中，通过经典eNOS/NO/PKG途径促进平滑肌舒张来维持血管壁稳态[19]。其中NO作为一种强有力的血管内皮细胞舒张因子，具有强烈的扩张血管作用，并广泛参与机体生理功能的调节。肝脏是NO主要合成场所，HSCs表达eNOS[20]。而eNOS可促进NO的合成，从而抑制细胞收缩产生舒张血管效应。有研究发现，激活的RhoA和ROCKⅡ可通过降低eNOS mRNA稳定性、抑制eNOS基因转录而降低eNOS水平[21]。在本实验中，模型组细胞内eNOS蛋白表达水平较空白组均显著降低，DSS含药血清各剂量组与模型组相比均可上调eNOS蛋白表达。本实验结果与文献结果相一致，提示在细胞层面，eNOS的表达可调控HSC-T6细胞的收缩，DSS可能通过增加eNOS的表达，升高NO的含量达到抑制细胞收缩的作用。

本实验研究发现，DSS含药血清各剂量组对HSCs具有不同程度的影响，DSS作为一种可能的降低门静脉高压延缓肝纤维化的药物，其对于细胞内介导HSCs收缩的钙离子通道是否存在调节，对α-平滑肌肌动蛋白是否存在影响，及其对其他细胞因子的作用，还有待进一步的研究。

综上所述，DSS含药血清可能通过下调RhoA、ROCKⅡ蛋白的表达，上调eNOS蛋白的表达，从而降低肝内血管阻力以及门静脉压力，起到对ET-1介导的HSCs收缩的保护作用。

参考文献：

[2] SAFADI R，FRIEDMAN S L.Hepatic fibrosis：role of hepatic stellate cell activation[J].Med Gen Med，2002，4(3):27.

[3] VAN BEUGE M M， PRAKASH J， LACOMBE M，et al.Reduction of fibrogenesis by selective delivery of a Rho kinase inhibitor to hepatic stellate cells in mice[J].J Pharmacol Exp Ther，2011，337(3):628-635.http://nc.yuntsg.com/one1.do.DOI: 10.1124/jpet.111.179143.

[4] VAN BEUGE M M，PRAKASH J，LACOMBE M，et al.Increased liver uptake and reduced hepatic stellate cell activation with a cell-specific conjugate of the Rho-kinase inhibitor Y27632[J].Pharm Res，2011，28(8):2045-2054 [2011-03-26].https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3130909.DOI:10.1007/s11095-011-0430-9.

[5] SOHAIL M A，HASHMI A Z，HAKIM W，et al.Adenosine induces loss of actin stress fibers and inhibits contraction in hepatic stellate cells via Rho inhibition[J]. Hepatology，2009，49(1):185-194. http://nc.yuntsg.com/one1.do.DOI: 10.1002/hep.22589.

[6] CHAKRABORTY J B，OAKLEY F，WALSH M J. Mechanisms and biomarkers of apoptosis in liver disease and fibrosis[J]. Int J Hepatol，2012，2012:648915. http://nc.yuntsg.com/show.do?q=22567408&my=

[7] FRIEDMAN S L.Mechanisms of hepatic fibrogenesis [J].Gas troenterology，2008，134:1655-1669. http://nc.yuntsg.com/show.do?q=18471545&my=1498613267930.DOI: 10.1053/j.gastro.2008.03.003.

[8] ZHOU Q，HENNENBERG M，TREBICKA J，et al.Intrahepatic upregulation of RhoA and Rho-kinase signalling contributes to increased hepatic vascular resistance in rats with secondary biliary cirrhosis[J].Gut，2006，55(9):1296-1305.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16492715.DOI:10.1136/gut.2005.081059.

[9] ANEGAWA G，KAWANAKA H，YOSHIDA D，et al.Defective endothelial nitric oxide synthase signaling is mediated by rho-kinase activation in rats with secondary biliary cirrhosis[J]. Hepatology，2008，47(3):966-977.

5）倍 点 原 则 ，设P1=(x1,y1)∈EP(a,b){O}，且 y1≠0 ，若P3=(x3,y3)=P1+P1，则(x3,y3)=(λ2-2x1,λ(x1-x3)-y1) ， 其 中

[10] 刘青云.中药药理学[M].2版.北京:人民卫生出版社，2002:127.

[11] 岳晓莉，王成业，姚瑶，等.当归芍药散对肝硬化腹水大鼠血管紧张素Ⅱ、内皮素-1的影响[J].安徽中医药大学学报，2015，34(1):111-115.

[12] 潘永福，许钒，王成业，等.基于水通道蛋白研究当归芍药散对肝硬化大鼠的干预作用[J].中国实验方剂学杂志，2015，21(8):111-115.

[13] TSUI J C，DASHWOOD M R.A role for endothelin-1 in peripheral vascular disease[J].Curr Vasc Pharm acol，2005，3(4):325-332.

[14] 李国强，潘永福，方庆，等.当归芍药散含药血清对ET-1诱导的HSC-T6细胞收缩的影响[J].中国临床药理学与治疗学，2016(4):361-365.

[15] KITAMURA K，TADA S，NAKAMOTO N，et al.Rho/Rho kinase is a key enzyme system involved in the angiotensin Ⅱ signaling pathway of liver fibrosis and steatosis[J].J Gastroenterol Hepatol，2007，22(11):2022-2033.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17914985.DOI:10.1111/j.1440-1746.2006.04735.x.

[16] HEASMAN S J，RIDLEY A J.Mammalian Rho GTPases:new insights into their functions frominvivostudies[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2008，9(9):690-701.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18719708.DOI: 10.1038/nrm2476.

[17] HARB N，ARCHER T K，SATO N.The Rho-Rock-Myosin signaling axis determines cell-cell integrity of self-renewing pluripotent stem cells[J].PLoS ONE，2008，3(8):e3001.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/?term=he+Rho-Rock-Myosin+signaling+axis+determines+cell-cell+integrity+of+self-renewing+pluripotent+stem+cells. DOI: 10.1371/journal.pone.0003001.

[18] 李斌.ROCK抑制剂Y-27632对角膜上皮的保护性作用及其机制的初步研究[D].济南：济南大学，2013.

[19] DUDZINSKI D M，MICHEL T.Life history of eNOS:partners and pathways[J].Cardiovasc Res，2007，75(2):247-260.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Life+History+of+eNOS%3APartners+and+Pathways.DOI:10.1016/j.cardiores.2007.03.023.

[20] KOJIMA H， SAKURAI S， KURIYAMA S，et al.Endothelin-1 plays a major role in portal hypertension of biliary cirrhotic rats through endothelin receptor subtype B together with subtype Ainvivo[J].J Hepatol，2001，34(6):805-811.

[21] RIKITAKE Y，LIAO J K. Rho GTPases，statins，and nitric oxide[J].Circ Res，2005，97(12):1232-1235.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Rho+GTPases%2Cstatins%2Cand+nitric+oxide.DOI: 10.1161/01.RES.0000196564.18314.23.