RANK-RANKL在2型糖尿病肾病大鼠肾脏表达的研究

刘素芳，刘丽秋，杨鹏鹏

(青岛大学附属医院 肾内科，山东 青岛266003)

如今，糖尿病的发病率伴随着人们生活水平的改善正日益增高，糖尿病肾病(DK)作为糖尿病严重的微血管并发症，其发病率也逐年攀升，成为糖尿病患者的主要死亡原因之一。NF-κB受体活化因子(RANK)及其配基RANKL是破骨细胞分化发育的关键作用因子[1-5]，近年来研究发现其在表达于糖尿病和多种肾脏疾病[6，7]，而在早期2型糖尿病肾病中的表达研究较少。本研究建立2型糖尿病肾病大鼠模型，观察肾脏中RANK、RANKL的表达，探讨其在糖尿病肾病发病中的作用。

1 材料与方法

1.1动物与试剂

SPF级8周龄雄性Wista大鼠40只，体重(180±20)g，购于山东鲁抗实验动物中心(许可证号SCXK(鲁)20130001)。链脲佐菌素( Streptozocin，STZ) (美国Sigma 公司)。兔抗鼠RANK、RANKL(美国Santa Cruz 公司)；山羊抗兔多克隆抗体(北京中杉金桥)；Trizol(日本Takara公司)；ACCU-CHEK血糖仪、反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(上海罗氏)，血清胰岛素(INS)ELISA试剂盒(武汉博士德)。

1.2模型建立和分组

动物饲养的温度控制在24-26℃，湿度65%，12 h交替照明。大鼠自由饮水、进食。大鼠适应性喂养5天后随机分为正常对照组(NC组，n=18)和模型组(DM组，n=22)，NC组给予常规饲料喂养。DM组给予高糖高脂饮食(常规饲料66.5%加20%蔗糖、10%猪油、2.5%胆固醇、1%胆酸盐)喂养8周后,DM组禁食12 h，空腹状态下STZ 30 mg/kg一次性腹腔注射，NC组仅注射等量枸橼酸缓冲液。DM组注射STZ一周后，内眦静脉取血测定空腹血糖(FPG)及空腹胰岛素(INS)，并计算胰岛素敏感指数ISI[ISI=22．5/(FPG×INS)，HOMA法]。FPG大于该实验正常大鼠空腹血糖均值+3个标准差(≥10．0 mmol/L)及胰岛素敏感指数≤正常动物均值(即胰岛素抵抗)，即为T2DM模型建立成功，纳入实验组。STZ注射2周后用代谢笼收集两组大鼠24小时尿液，检测24小时尿微量白蛋白。经统计学分析证明DM组大鼠24 h尿微量白蛋白定量较NC组高，说明糖尿病肾病DK动物模型制备成功(共18只)。

1.3观察指标和检测方法

1.3.1标本收集 给药后4、8、12周末分别用代谢笼收集大鼠24 h尿液，测尿量，称体重，用10%水合氯醛麻醉后腹主动脉取血，4℃离心，取上层血清存于-80℃冰箱中待测生化指标；取左肾，剪成1 mm肾皮质以2．5%戊二醛固定用于电镜检测；取部分肾组织放于10%中性甲醛固定用于免疫组化；取右肾称重后速冻于液氮中，冻透后转入-80℃冰箱中待行Western-blot检测。

1.3.2血、尿生化指标检测 利用日本日立公司的7020生化分析仪检测空腹血糖(FPG)、血肌酐(Scr)、总胆固醇(TC)、血甘油三酯(TG)、24小时尿白蛋白定量(UAL)。血清胰岛素的检测按照试剂盒说明书操作，采用ELISA法检测。

1.3.3肾脏病理检查 光镜行HE染色放大200倍观察肾脏病理变化。

1.3.4免疫组化染色 操作步骤按试剂盒说明书进行。一抗为RANK、RANKL多克隆抗体(均1∶200稀释比)。实验结果用Image pro Plus 5.7图像分析软件对所选取视野中免疫组织化学阳性信号进行图像分析，光镜下每张切片随机选择5个视野，计算阳性细胞百分率(R)评分A(R<1%为0分，1%≤R≤10%为1分，10%

1.3.5Western 印迹法测蛋白 取冻存肾皮质约150 mg，用BCA法测蛋白浓度，与5×上样缓冲液混合煮沸5 rain后电泳。各泳道分别加彩色预染Marker及样品蛋白进行SDS、PAGE电泳、转膜、封闭后分别加入待测多克隆抗体，过夜、洗膜，加二抗孵育2 h。用Odyssey双色红外激光成像系统扫描，扫描结果用GISl0分析软件将图片上每个特异条带灰度值数据化，进行半定量分析。

2 结果

2.1各组大鼠一般情况

实验组大鼠于造模三天后出现多饮、多食、多尿症状,常有腹泄,毛发干枯发黄。实验过程中,随时间的推移，体重明显减轻,活动量减少,精神萎靡。正常对照组大鼠皮毛光滑，毛色正常,体重随周龄增加而增加,血糖值稳定于正常水平,精神佳,饮食、饮水正常,尿淡黄色,大便颗粒状。

2.2大鼠模型的建立

大鼠高糖高脂喂养8周后，DM组FPG和INS即高于NC组,ISI显著降低，表明存在胰岛素抵抗。STZ注射2周后，DM组FPG升高更加显著，已达到糖尿病标准，INS仍高于NC组，同时24小时尿微量白蛋白定量升高(P<0.05)，表明2型糖尿病肾病动物模型制备成功(见表1)。

表1 不同时间各组大鼠血糖、胰岛素的比较表

注：与对照组相比，*P<0.01，aP<0.05

2.3各组大鼠生化指标的比较

与NC组大鼠相比较,DK组大鼠FPG、UAL在造模4W、8W、12W末时均明显升高 (均P<0.01)，而Scr、TG、TG在4W时开始升高(P<0.05)，8W、12 W时均显著升高，差异有统计学意义(均P<0.01)；NC组大鼠上述指标在4W、8W、12 W末时无明显变化(P>0.05)，而DK组上述指标在8W、12 W末较4W末存在明显差异，差异具有统计学意义(均P<0.01)(见表2)。

表2 不同时间各组大鼠指标的比较

注：同时间与对照组比较*P<0.01，#P<0.05；各组内与4周末比较aP<0.01，bP>0.05

2.4各组大鼠肾脏病理形态学观察

HE染色结果发现，与NC组相比，DK组的肾脏病理变化在4W时不明显，8W时，DK组肾小球体积增大，系膜区面积增宽，局灶性的系膜基质增加。12周时DK上述变化更加明显，肾小球基底膜增厚，肾小囊腔明显狭小，可见轻微肾小球硬化(见图1)。

图1 各组大鼠肾组织4周、8周和12周的病理变化 (HE×200)

2.5不同时间各组大鼠肾组织免疫组化和Westen-blot表达的比较

免疫组化可见RANK、RANKL在NC组大鼠肾脏极少表达，与NC组相比，DK组肾小球中RANK、RANKL阳性表达在4W时开始升高，8W、12W时增高更加显著，且RANK、RANKL主要表达于肾小球足细胞、血管内皮细胞，肾间质存在少量表达；DK组其RANK、RANKL表达在4W、8W、12W逐渐升高(见图2、3)。Westen-blot结果与免疫组化的变化趋势一致(见图4)。

2.6相关分析结果

相关分析结果显示RANK的免疫组化表达积分与血糖、尿蛋白的表达水平呈明显正相关，r分别为0.80、0.84，均P<0.01。

3 讨论

随着糖尿病的发病率逐年提高，其微血管并发症之一糖尿病肾病(DK)已成为终末期肾病(ESRD)的重要原因，严重危害人类健康。DK以持续性蛋白尿为主要临床表现，随着病情的进展和尿蛋白量的增加，肾功能逐渐恶化，晚期可发展为肾小球硬化和肾脏纤维化[8,9]。临床上糖尿病肾病的发病以2型多见，故本实验采用高糖高脂喂养加STZ注射法建立2型糖尿病肾病动物模型[10,11]，实验中观察到模型组大鼠高糖高脂喂养8周时血糖开始升高，出现胰岛素抵抗。STZ注射2周后，模型组血糖及胰岛素水平较对照组明显升高，并出现蛋白尿。病理可见肾小球系膜基质增多，基底膜较对照组明显增厚，可见轻微肾小球硬化，证实这些大鼠DN模型已制作成功。

图2 不同时间各组大鼠肾脏组织RANK的表达(免疫组化×200)

图3 不同时间各组大鼠肾脏组织RANKL的表达(免疫组化×200)

图4 不同时间各组大鼠肾组织RANK、RANKL的蛋白表达(Western印记)

RANK(NF-κB受体活化因子)及其配基RANKL作为TNF受体超家族成员之一，最初是在破骨细胞研究中被发现的，被证实为破骨细胞分化发育的关键作用因子[1-5]。既往的研究主要集中在骨系统疾病，近年来人们研究发现RANK/RANKL广泛表达于各种组织和细胞，并参与多种疾病的发生发展[12-14]。国外学者研究发现血清可溶性RANKL浓度升高可以反映人类2型糖尿病的发病程度，通过下调小鼠肝细胞RANKL的表达和敲除小鼠RANK基因，可以明显改善胰岛素抵抗及血糖水平[14]。另外有学者研究发现RANK/RANKL在正常足细胞上表达水平较低，在IgA肾病等人类肾小球疾病中表达明显增加，且主要表达于足细胞[6,7]；嘌呤霉素氨基核苷及5/6切除肾鼠均可诱导足细胞产生RANK及RANKL，并诱导足细胞凋亡[15,16]。而RANK/RANKL在糖尿病肾病发病过程中的表达和作用，目前研究较少。

本实验建立2型糖尿病肾病动物模型，免疫组化和western印迹观察到对照组大鼠肾组织中RANK、RANKL表达量极少，与对照组相比，模型组大鼠肾脏中RANK及RANKL表达在4周、8周、12周时均显著升高，随着时间的推移其阳性表达明显增多，且主要表达于肾小球足细胞和血管内皮细胞，肾间质存在少许表达。另外观察到模型组蛋白尿明显增多，肾小球出现轻微硬化，表明发生了足细胞的损伤。RANK/RANKL基因表达可以增加肝脏胰岛素抵抗和升高血糖[14]，本研究观察到模型组肾脏中RANK/RANKL表达明显增强，血糖和胰岛素抵抗较对照组明显升高，相关分析发现RANK表达与血糖的水平呈明显正相关，由此我们猜测肾脏中RANK/RANKL表达可能对胰岛素抵抗和血糖的升高存在一定作用。相关分析发现RANK表达量与尿蛋白水平呈明显正相关，提示RANK高表达可能导致蛋白尿的一个重要因素。

本实验发现糖尿病肾病大鼠肾脏中RANK/RANKL的表达增加，加重了糖尿病肾病蛋白尿的产生和血糖的升高，可能参与了2型糖尿病肾脏早期的发病过程，为糖尿病肾病的发病机制和治疗找到了新的方向。

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