外源淀粉酶对肉鸡玉米-豆粕型饲粮体外养分消化率和代谢能的影响

张 宪 张乐颖 张立兰 陈 亮* 唐湘方 张宏福

(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京 100193；2.河北工程大学生命科学与食品工程学院，邯郸 056000)

外源酶制剂具有提高饲料养分消化率、改善动物生长性能和维持动物健康等优点，已成为饲料营养领域的研究热点之一。但外源酶制剂的效果不仅取决于其本身的酶学特性，还与目标动物的生理状况及基础饲粮类型密切相关。因此，准确评价和使用饲用酶制剂的问题亟待解决。传统的动物试验法评定饲用酶常耗费大量的人力、财力和物力，测试条件不可控性，结果变异大，不能在短时间内进行评定[1-2]。研究发现添加单一α-淀粉酶可提高饲粮的有机物消化率和淀粉消化率以及代谢能，提高肉仔鸡的日增重和饲料转化率[3-6]；但也有研究显示α-淀粉酶对肉仔鸡前期(1～14日龄)饲粮的淀粉消化率没有促进作用[7]，对肉仔鸡的生长性能没有产生正效应[8]。外源淀粉酶的作用效果受到饲粮类型及酶制剂的来源和添加剂量等因素的影响，所得结果不尽一致。国内外学者们试图探索研究快速、易标准化的外源酶制剂有效性评价的体外法。Alabi等[9]和Malathi等[10]均提出胃蛋白酶-胰液素体外法能够快速评价外源酶的有效性和稳定性。Park等[11]研究表明含有α-外源淀粉酶的复合酶制剂增加了玉米和小麦的体外干物质消化率。虽然体外法评定外源淀粉酶的应用研究取得一定进展，但各实验室评定酶制剂的方法、试验材料及条件变异性大，导致评价外源酶制剂有效性的方法不稳定。本课题组长期研究饲用酶制剂的有效性快速评价方法，通过仿生法评定了外源蛋白酶对饲粮养分消化率的影响[12]，建立了猪禽饲粮非淀粉多糖酶快速筛选平台，利用仿生法研究了非淀粉多糖酶的作用效果[13]。但利用体外法评价单一外源淀粉酶有效性的报道极少。本试验旨在利用单胃动物仿生消化系统(SDS-Ⅱ)模拟鸡胃阶段和全消化道的消化过程，通过研究外源淀粉酶对饲粮体外干物质消化率(invitrodry matter digestibility，IVDMD)、体外总能消化率(invitrogross energy digestibility，IVGED)、体外表观粗蛋白质消化率(invitroapparent crude protein digestibility，IVACPD)、体外标准化粗蛋白质消化率(invitrostandardized crude protein digestibility，IVSCPD)、体外淀粉消化率(invitrostarch digestibility，IVSTD)和体外代谢能(invitrometabolic energy，IVME)的影响，为准确评价和使用饲用酶制剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

本试验于2016年12月至2017年3月在中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室进行。

本试验采用2×4双因素完全随机设计。试验饲粮参照我国《鸡饲养标准》[14](NY/T 33—2004)和NRC(1994)[15]鸡营养需要配制肉鸡1～21日龄和22～42日龄基础饲粮。以2种基础饲粮为对照组，分别在2种基础饲粮中添加1 840、9 200和18 400 U/g的外源α-淀粉酶(α-淀粉酶由北京益农饲料中心提供，活性为24 500 U/g，1个淀粉酶活性单位定义为25 ℃、pH=6.90条件下作用1 min释放1 μmol麦芽糖所具有的酶的活性)作为试验组，共8个饲粮样品组，每组设5个重复，每个重复设1根消化管。饲粮样品采用四分法取样后经试验用饲料粉碎机粉碎过60目筛，充分混合均匀后，保存于-20 ℃备用。基础饲粮组成见表1，试验饲粮常规营养成分含量见表2。

1.2 试验方法

本试验采用SDS-Ⅱ，通过配制胃缓冲液、小肠缓冲液、模拟胃液、模拟小肠液，模拟鸡胃阶段和全消化道消化过程，并对结果进行分析，从而评定外源淀粉酶对1～21日龄和22～42日龄肉鸡玉米-豆粕型基础饲粮IVDMD、IVGED、IVACPD、IVSCPD、IVSTD及IVME的影响。操作步骤及参数设置均按《单胃动物仿生消化系统操作手册》[16]进行。

1.2.1 胃缓冲液、小肠缓冲液、模拟胃液、模拟小肠液的配制

胃缓冲液及小肠缓冲液的组成见表3。各段缓冲液的配制均用去离子水溶解，在41 ℃下调节溶液的pH并定容到2 000 mL。胃段缓冲液用2 mol/L盐酸调节pH至2.00，小肠前段和小肠后段缓冲液均用1 mol/L氢氧化钠调节pH分别至6.50和7.99。配制好的缓冲液放入SDS-Ⅱ的相应位置进行预热。

模拟胃液(胃蛋白酶活性1 550 U/mL)：称取 387.5 kU的胃蛋白酶(Sigma，P7000)溶解于250 mL pH 2.0的盐酸缓冲溶液中(41 ℃下标定pH)，缓慢搅拌至溶解(临用前配制)。

模拟小肠液(淀粉酶活性401.46 U/mL，胰蛋白酶活性49.28 U/mL，糜蛋白酶活性11.31 U/mL)：称取110.40 kU淀粉酶(Sigma，A3306)、13.55 kU胰蛋白酶(Amersco，0785)、3.11 kU糜蛋白酶(Amersco，0164)溶解于25 mL去离子水中，缓慢搅拌直至溶解(临用前配制)。

表1 基础饲粮组成(风干基础)

预混料为每千克饲粮提供The premix provided the following per kg of diets：VA 12 000 IU，VB13.5 mg，VB28.6 mg，VB120.02 mg，VD325 000 IU，VE 20 IU，VK332.5 mg，生物素 biotin 0.20 mg，叶酸 folic acid 1.00 mg，D-泛酸D-pantothenic acid 15 mg，烟酸 nicotinic acid 50 mg，Cu (as copper sulfate) 8 mg，Fe (as ferrous sulfate) 80 mg，Mn (as manganese sulfate) 120 mg，Zn (as zinc sulfate) 110 mg，Se (as sodium selenite) 0.30 mg。

表2 试验饲粮常规营养成分含量(干物质基础)

1.2.2 操作步骤

称取2.000 0 g饲粮样品(精确到0.000 2 g)，加入20 mL模拟胃液，无损转移到装有透析袋(截留分子质量为14 000 u)的模拟消化管中，用胶塞塞严，并安装于预热好的SDS-Ⅱ上，胃阶段模拟消化参数温度为41 ℃，消化时间为4 h。在胃阶段模拟消化结束后，将2 mL模拟小肠液加入小肠消化液储备室，继续进行小肠阶段的模拟消化，其消化参数温度为41 ℃，小肠前段和小肠后段消化时间均为7.5 h。

消化过程结束后，将透析袋内未消化残渣无损转移到已知绝干重量的培养皿中，置于65 ℃烘箱中8～10 h后，再将烘箱调至105 ℃恒重4 h，记录重量。

表3 胃缓冲液及小肠缓冲液组成

将培养皿中的消化残渣全部刮下，取0.3 g残渣测定残渣粗蛋白质含量，取0.1 g残渣测定残渣淀粉含量，剩余残渣称重后转移到已知绝干重量的玻璃砂芯坩埚中，用无水乙醇进行3次脱脂后，待无水乙醇完全挥发，置于105 ℃烘箱恒重，记录重量。

在进行仿生消化试验时，同步测定饲粮样品的干物质、粗蛋白质和淀粉含量及总能。

1.2.3 计算公式

数据计算公式如下：

IVDMD(%)=100×(M1-M2)/M1；IVGED(%)=100×(GE1-GE2)/GE1；IVACPD(%)=100×(CP1-CP2)/CP1；IVSCPD(%)=100×(CP1-CP2+CP0)/CP1；IVSTD(%)=100×(ST1-ST2)/ST1；IVME(MJ/kg)=(GE1-GE2)/(GE1×1 000)。

式中：M1为上样饲粮干物质重量(g)；M2为未消化残渣干物质重量(g)；GE1为上样饲粮总能(J)；GE2为未消化残渣总能(J)；CP0为粗蛋白质内源损失量(g)；CP1为上样饲粮粗蛋白质重量(g)；CP2为未消化残渣粗蛋白质重量(g)；ST1为上样饲粮淀粉重量(g)；ST2为未消化残渣淀粉质量(g)。

1.3 数据统计分析

试验数据采用SAS 9.2的MEANS模块对基本统计量进行分析，用GLM模块对数据进行双因素方差分析，当存在交互作用(P<0.05)时，对平均值进行Turkey法多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 饲粮营养水平和淀粉酶添加剂量对肉鸡饲粮IVDMD、IVGED和IVME的影响

由表4可知，饲粮营养水平和淀粉酶添加剂量对肉鸡饲粮IVDMD、IVGED和IVME存在交互作用(P<0.01)。在饲粮中添加不同剂量的淀粉酶后，胃阶段的IVDMD和IVGED均显著增加(P<0.05)，1～21日龄饲粮的IVDMD和IVGED显著高于22～42日龄饲粮(P<0.01)；1 840 U/g淀粉酶组全消化道的IVDMD和IVGED显著低于其他组(P<0.05)，22～42日龄饲粮全消化道IVDMD和IVGED显著高于1～21日龄饲粮(P<0.05)；18 400 U/g淀粉酶组饲粮的IVME显著高于其他组(P<0.05)，22～42日龄饲粮的IVME显著高于1～21日龄饲粮(P<0.05)。

在1～21日龄饲粮中，9 200和18 400 U/g淀粉酶组胃阶段、全消化道的IVDMD和胃阶段的IVGED均显著高于对照组和1 840 U/g淀粉酶组(P<0.05)；9 200和18 400 U/g淀粉酶组的IVME显著高于对照组(P<0.05)，分别较对照组提高了0.14和0.18 MJ/kg。

在22～42日龄饲粮中，1 840、9 200和18 400 U/g淀粉酶组胃阶段的IVDMD和IVGED均显著高于对照组(P<0.05)；与对照组相比，1 840 U/g淀粉酶组全消化道IVDMD和IVGED均显著降低(P<0.05)，9 200 U/g淀粉酶组全消化道IVDMD显著降低(P<0.05)；1 840 U/g淀粉酶组的IVME显著低于对照组(P<0.05)，9 200和18 400 U/g淀粉酶组与对照组差异不显著(P>0.05)。

表4 饲粮营养水平和淀粉酶添加剂量对肉鸡饲粮IVDMD和IVGED以及IVME的影响

相同因素下，同行数据肩标相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

Under the same factor, values in the same row with the same letter or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 饲粮营养水平和淀粉酶添加剂量对肉鸡饲粮IVACPD、IVSCPD和IVSTD的影响

由表5可知，饲粮营养水平和淀粉酶添加剂量对肉鸡饲粮IVACPD、IVSCPD和IVSTD存在交互作用(P<0.01)。1 840和9 200 U/g淀粉酶组的全消化道IVACPD、IVSCPD显著高于对照组(P<0.05)，且22～42日龄饲粮的全消化道IVACPD、IVSCPD显著高于1～21日龄饲粮(P<0.05)；8种饲粮的全消化道IVSTD均在99.40%以上，9 200和18 400 U/g淀粉酶组的全消化道IVSTD显著低于对照组(P<0.05)，1～21日龄饲粮的全消化道IVSTD显著高于22～42日龄饲粮(P<0.05)。

在1～21日龄饲粮中，9 200和18 400 U/g淀粉酶组的全消化道IVACPD、IVSCPD均显著高于对照组(P<0.05)；9 200和18 400 U/g淀粉酶组的全消化道IVSTD低于对照组(P<0.01)。

在22～42日龄饲粮中，18 400 U/g淀粉酶组的全消化道IVACPD、IVSCPD均显著低于其他组(P<0.05)，1 840和9 200 U/g淀粉酶组上述指标与对照组相比无显著差异(P>0.05)；各淀粉酶添加组的全消化道IVSTD与对照组相比无显著差异(P>0.05)。

表5 饲粮营养水平和淀粉酶添加剂量对肉鸡饲粮IVACPD、IVSCPD和IVSTD的影响

3 讨 论

外源淀粉酶的作用效果受到淀粉酶来源、添加剂量和饲粮营养水平等因素的影响。Gracia等[3]研究发现，添加单一α-淀粉酶可提高玉米-豆粕饲粮有机物和淀粉的消化率以及代谢能，但对粗蛋白质和粗脂肪的消化率没有显著影响。单一α-淀粉酶也可提高肉仔鸡的日增重和饲料转化率[4-5]。但Mahagna等[7]的研究显示α-淀粉酶对肉仔鸡前期(1～14日龄)饲粮的淀粉消化率没有促进作用，Kaczmarek等[6]也发现添加单一α-淀粉酶对玉米-豆粕型饲粮淀粉和粗蛋白质的消化率以及代谢能没有显著影响，对肉仔鸡的生产性能没有正效应。本试验利用SDS-Ⅱ分析了饲粮营养水平和淀粉酶添加剂量对肉鸡饲粮体外养分消化率和代谢能的影响，为快速准确评价和使用饲用酶制剂提供参考。

3.1 饲粮营养水平和淀粉酶添加剂量对肉鸡饲粮体外养分消化率的影响

外源酶制剂对肉鸡养分消化的影响作用与饲粮营养水平密切相关[17-18]，但单一外源淀粉酶与饲粮营养水平对肉鸡饲粮养分消化率的影响报道很少。本研究中1～21日龄饲粮为高蛋白质、低能量饲粮，22～42日龄饲粮为低蛋白质、高能量饲粮，研究结果表明饲粮营养水平与淀粉酶添加剂量对肉鸡饲粮体外养分消化率存在交互作用，外源淀粉酶对1～21日龄饲粮营养水平下饲粮体外养分消化率的影响更明显，饲粮能量水平越低，外源淀粉酶的作用越明显，相关动物试验也得到相似的结果。在降低代谢能 836 kJ/kg的肉仔鸡饲粮中，复合酶制剂(含有α-淀粉酶)对18～21日龄饲粮全消化道干物质、粗蛋白质及能量消化率提升效果比42日龄饲粮更明显[17]。黄学琴[18]也发现酶制剂提高了不同营养水平的肉鸭饲粮的粗蛋白质利用率，饲粮代谢能水平越低，外源酶制剂对粗蛋白质消化率的作用越明显。

3.2 外源淀粉酶对肉鸡饲粮IVACPD、IVSCPD和IVSTD的影响

由于幼雏鸡消化系统发育不成熟，自身分泌的消化酶不足以消化吸收饲料中的养分，影响后续的生长发育，有必要添加外源酶来补充内源酶的不足并促进肠道的早期发育。Gracia等[3]研究发现，在饲粮中添加外源淀粉酶后，肉仔鸡在7日龄时提高了粗蛋白质消化率和淀粉消化率，到28日龄时淀粉消化率仍高于对照组，但降低了粗蛋白质的消化率且差异不显著。本试验通过SDS-Ⅱ分别模拟肉仔鸡1～21日龄和22～42日龄饲粮的体内消化过程，当添加9 200和18 400 U/g淀粉酶时显著提高了1～21日龄饲粮的IVACPD和IVSCPD，但对22～42日龄饲粮的IVACPD和IVSCPD提升效果不显著，这与前人采用动物试验法[17]研究外源淀粉酶影响粗蛋白质消化率的结果相似，可能是外源淀粉酶与内源蛋白酶互作的结果。蒋正宇等[19]在21日龄肉仔鸡玉米-豆粕型饲粮中分别添加250、750、2 250 mg/kg微生物α-淀粉酶，均不同程度提高了肉仔鸡前肠内容物中总蛋白酶和胰蛋白酶活性。本试验中粗蛋白质消化率的提高可能是由于外源淀粉酶增加了内源酶的活性，从而改善了饲粮养分消化率，但也有研究表明粗蛋白质消化率的提高可能是由于外源淀粉酶通过分解淀粉，减少了淀粉大分子空间占位对蛋白质消化的阻隔作用，从而促进了蛋白质的消化吸收[20]。

尽管添加9 200和18 400 U/g淀粉酶在统计学上显著降低了1～21日龄饲粮的全肠道IVSTD，但外源淀粉酶对淀粉消化率的提升作用甚微，因为在体外模拟消化条件下，玉米-豆粕型饲粮中的淀粉几乎完全降解，8种饲粮的全肠道IVSTD均在99.40%以上。淀粉消化率与动物自身淀粉酶分泌量相关，肉仔鸡在4日龄时自身淀粉酶的分泌量较低，但随日龄的增长其分泌量随之增加，然后趋于稳定[21]。

3.3 外源淀粉酶对肉鸡饲粮IVDMD和IVGED的影响

由于胃内环境呈酸性，容易破坏外源酶活性，Ao等[22]通过模拟禽类不同消化道的pH，对β-葡聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、α-半乳糖苷酶和蛋白酶进行活性测定，结果表明禽类消化道的pH可能是外源酶活性的最大限制性因素。在本试验条件下，添加9 200和18 400 U/g淀粉酶均提高了1～21日龄和22～42日龄饲粮胃阶段的IVDMD，说明试验中所用的外源淀粉酶具有耐胃酸性，并且提高了胃阶段的养分消化率。相似的研究也表明，将含有α-淀粉酶(活性≥8.5×106U/t)的复合酶添加到玉米和豆粕等原料中，测得玉米的IVDMD和IVGED分别提高了2.07%和2.82%，豆粕的IVDMD和IVGED分别提高了5.00%和0.26%[23]。本试验结果显示，添加外源淀粉酶后，肉鸡饲粮的IVDMD、IVGED和IVME得到提高，说明在体外消化试验中外源淀粉酶的添加能够提高饲粮中的可消化养分(如粗蛋白质)。

研究认为少量添加酶制剂能增强内源酶作用，中等剂量的添加对内源酶有降解作用，高剂量添加外源酶则又显示正效应[24]，外源酶与内源酶的作用效果取决于酶的来源、作用底物、添加量等因素，其作用机理还有待进一步研究。

4 结 论

① 外源淀粉酶的添加提高了肉鸡饲粮胃阶段的IVDMD、IVDGE，1 840和9 200 U/g外源淀粉酶提高了肉鸡饲粮的IVACPD和IVSCPD，18 400 U/g淀粉酶提高了肉鸡饲粮的IVME。

② 玉米-豆粕型饲粮中淀粉几乎完全降解，外源淀粉酶对IVSTD的影响可以忽略。

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③ 饲粮营养水平和外源淀粉酶添加剂量对肉鸡饲粮体外养分消化率和代谢能存在交互作用，22～42日龄饲粮的体外养分消化率和代谢能均高于1～21日龄饲粮。

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