洋甘菊抑制酪氨酸酶活性成分研究

王国林，　达热卓玛， 徐德平*

（江南大学 食品学院，江苏 无锡214122）

罗马洋甘菊（Anthemis nobilis L.），菊科黄春菊属一年生或多年生草本植物，广布于南欧和西欧，目前在我国新疆也有种植。罗马洋甘菊（以下简称洋甘菊）有极强的香味，在医药、香料和化妆品的生产中有广泛的应用。洋甘菊水提物在降低STZ糖尿病大鼠的血糖含量中有显著效果[1]，洋甘菊精油能减缓经期综合症[2]，帮助肝脏再生和解痉等。另外，洋甘菊精油还可以作为香薰按摩和护发产品中的成分[3-4]。在化妆品中添加洋甘菊可以使皮肤更加舒缓和柔滑[5-6]，但对其在美白方面的研究还未见报道。

为此，本文对洋甘菊提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用进行了研究，旨在明确洋甘菊乙醇提取物中的起美白作用的物质，为洋甘菊在美白方面的应用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

罗马洋甘菊，购于新疆伊犁；L-酪氨酸 （生化级），国药集团化学试剂有限公司产品；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠皆为分析纯，国药集团化学试剂有限公司产品；酪氨酸酶（生化级），上海宝曼生物科技有限公司产品。 MCI CHP20P（75～150 μm）柱填料，Mitsubishi Kasei Co. 产品；ODS 柱填料，Nacalai Tosoh Inc产品。

1.2　仪器与设备

RAT-100型萃取罐，无锡申科仪器有限公司产品；R-1002型旋转仪，上海申顺生物科技有限公司产品；ZF-90型暗箱式紫外透射仪，上海顾村电光仪器厂制造；WFJ 2000型可见分光光度计，优尼柯（上海）仪器有限公司产品；核磁共振仪Avance 500 MHz，Bruer公司产品。

1.3　实验方法

1.3.1洋甘菊醇提物的制备洋甘菊经水蒸汽蒸馏法去除挥发性成分后得到的残渣，按料液质量比1∶5加入体积分数95%的乙醇，于50℃条件下搅拌提取3 h，过滤取上清液，如此重复2次。将3次所得上清液减压浓缩去乙醇后即得洋甘菊醇提物浓缩液，-20℃保存备用。

1.3.2洋甘菊醇提物的粗分离将2.1所得洋甘菊提取物解冻后，用去离子水作适当稀释，过虑后将滤液上MCI柱（5 cm×100 cm），依次用去离子水和不同体积分数乙醇以15 mL/min流速进行梯度洗脱。TCL检测，茴香醛-硫酸显色，将洗脱液分成A（水洗脱）、B（15%洗脱）、C（30%洗脱）、D（70%洗脱）4 个部分所得洗脱物分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。分别减压浓缩并真空干燥后，于-20℃保存备用。

1.3.3洋甘菊醇提物对酪氨酸酶抑制作用的研究

1）试剂的配制

①缓冲溶液 （PBS）的配制准确称取Na2HPO43.55 g，NaH2PO4·2H2O 3.9 g， 分别用去离子水溶解后混合，定容至1 000 mL，调pH至6.8，配成25 mmol/L的缓冲溶液，置于4℃冰箱中待用。

②1 mmol/L酪氨酸溶液的配制准确称取L-酪氨酸181 mg，加入数滴0.1 mol/L盐酸溶解后，加约95 mL磷酸缓冲溶液，调节其pH至6.8，然后定容至100 mL。置于4℃冰箱中待用。

③酪氨酸酶溶液的配制将酪氨酸酶用已配好的磷酸缓冲液溶解分装于PE管，置于-20℃冰箱中保存。

④样品的配制准确称取120 mg 1.3.1所得样品和1.3.2所得的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4个样品，2.1所得样品用含体积分数10%DMSO、pH为6.8的PBS溶解，2.2所得4个样品用PBS溶解，均配制成8 mg/mL的溶液备用。

2）洋甘菊乙醇粗提物对酪氨酸酶活性的测定酪氨酸酶抑制率的测定参考任红荣[7]的方法并稍加改动。 按表 1 准确吸取 T1、T2、C1、C24 组反应液，在37℃的水浴中恒温20 min后，各加入240 μL酪氨酸酶溶液，充分混匀，反应30 min后，迅速冷却以减慢反应，然后移入比色皿中，于475 nm处测吸光度AT1、AT2、AC1、AC2，按公式 1 求抑制率。

表1　反应液组成与体积Table 1　Composition and volume of the reaction solution

3）不同体积分数乙醇洗脱物对酪氨酸酶抑制率的测定根据1.3.3中2）的方法，在反应体系中分别加不同质量浓度的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4个样品，测定各部分对酪氨酸酶的抑制率。

1.3.4洋甘菊醇提物MCI 30%（体积分数）乙醇洗脱物的分离纯化将30%（体积分数）乙醇洗脱物用适量的去离子水溶解后，过MCI柱（5 cm×100 cm），用30%（体积分数）的乙醇洗脱，将洗脱液分成A、B、C 3个部分。分别将各部分依次过MCI（3 cm×100 cm）柱和ODS-A柱（3 cm×100 cm），经TCL鉴定纯度，共得 3个纯化合物 1、2、3。

2　结果与分析

表2　不同体积分数乙醇洗脱物对酪氨酸酶活性的抑制作用Table 2　Inhibition of tyrosinase activity by different ethanol concentration elution

2.1　洋甘菊乙醇粗提物对酪氨酸酶活性的测定

对洋甘菊体积分数95%乙醇提物对酪氨酸酶活性的抑制率如图1。

图1　乙醇粗提物对酪氨酸酶活性的抑制Fig.1　Inhibition of tyrosinase by crude ethanol extract

从图可知，洋甘菊体积分数95%乙醇提物对酪氨酸酶的活性有抑制作用，并且在提取物质量浓度小于200 μg/mL时，抑制率随着质量浓度的增加而增加较快；当提取物质量浓度大于200 μg/mL时，抑制率随着质量浓度的增加而较慢。

2.2　不同体积分数乙醇洗脱物对酪氨酸酶活性的抑制作用

对洋甘菊醇提物经MCI柱后不同体积分数乙醇洗脱物对酪氨酸酶活性的抑制率如表2所示。

由表2的实验结果可知，在不同体积分数乙醇洗脱中，30%（体积分数）乙醇浓度洗脱物对酪氨酸酶活性的抑制率最灵敏，并且随着样品质量浓度的增加，抑制率趋于平衡。而水洗物和体积分数70%乙醇洗脱物对酪氨酸酶活性的抑制率都较低。因此，本文针对洋甘菊乙醇粗提物的30%（体积分数）乙醇洗脱物部位进行进一步的分离纯化研究。

2.3　30%体积分数乙醇洗脱物的分离

对30%体积分数乙醇洗脱物经反复上MCI柱和ODS-A柱后，TCL检测，茴香醛-硫酸显色，得到3个单体化合物。

2.4　活性物质的确定

以二甲亚砜为溶剂，四甲基硅烷（TMS）为内标物，将上述3个化合物经氢谱和碳谱等光谱数据分析，确定其结构。

1）化合物1,淡黄色粉状物，易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，可溶于水。

表3　化合物1、2、3的13C-NMR数据Table 3　Signals of carbon in the13C-NMR 0f 1，2 and 3

由化合物1的1H-NMR谱图可知，δ 8.06处有2个质子信号，J=8.9 Hz，δ 6.88有2个质子信号，J=8.9 Hz，说明该化合物中含有1个对位取代苯环，这4 个氢均为苯环上的氢。δ 6.44（1H，d，J=2.0），δ 6.21（1H，d，J=2.0）为苯环上的间位质子信号，是连有羟基的碳邻位碳上的氢。δ 5.46处的质子信号为糖的端基质子，J=7.1，可知该糖为β构型。δ 3.33～δ 4.95处的质子信号为糖上的其他氢。化合物1的13CNMR数据如表3所示，经与文献[9]相比较，可判断该化合物为山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。其结构见图2左上。

2）化合物2，淡黄色粉状物，易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，可溶于水。

从化合物2的1H-NMR谱可见，δ 6.20，δ 6.40（1H，d，J=2.0）处各有 1个质子，为苯环上的间位氢。δ 6.86，δ 7.57，δ 7.59 处各有 1 个质子信号，从偶合常来看是同一个苯环的3个氢。δ 5.47（H，d，J=7.0 Hz）处为葡萄糖端基质子信号，δ 3.45～δ 3.59为糖上的其他质子信号。化合物2的13C-NMR数据表如表3所示，化合物2中有21个碳，其中6个碳为糖中的碳，一个为甲氧基。将其余15个碳的碳信号与文献[10]参比，可知化合物2为应为异鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。其结构见图2右上。

3）化合物3，淡黄色粉状物，易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，可溶于水。从1H-NMR、13C-NMR谱中可见，化合物3与化合物1的母环结构一样，2、但不同之处为化合物3糖C6位连有一个3-羟基-3-甲基-戊二酰基团。黄酮上连有3-羟基-3-甲基-戊二酰基团可能是乙酰辅酶A或L-亮氨酸在洋甘菊代谢合成异戊烯二磷酸过程中的中间产物。GABRIELA M.等人[10]在1996年就从洋甘菊水提物中分离并解出该化合物。该化合物在洋甘菊中含量较少。其结构见图2下。

3　结　语

研究发现，洋甘菊体积分数95%乙醇提取物对酪氨酸酶的活性有抑制作用，并且经MCI柱后30%（体积分数）乙醇洗脱物对酪氨酸酶的抑制最灵敏。从30%（体积分数）乙醇洗脱物中分离得到3个化合物，经NMR鉴定为山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、山奈酚-3-O-（6"-3-羟基-3-甲基-戊二酰基）-β-D-吡喃葡萄糖苷，都是黄酮类化合物。由此可以推测对酪氨酸酶的活性有抑制作用的成分应是黄酮类，这与文献[11]中报道甘草中胱甘草腚（黄酮类物质）对酪氨酸酶有强抑制作用的报道相类似。因此，本研究确定了洋甘菊美白作用的物质基础，为洋甘菊美白护肤品的开发提供理论依据。

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