武天琦,张欣,张智*,张晓华
(1.东北林业大学,哈尔滨 150040;2.黑龙江省轻工科学研究院,哈尔滨 150010;3.牡丹江市食品药品检测中心)
红松松针是红松(Pinuskoraiensis)的叶。红松松针具有再生速度快、分布范围广、天然储量大、可持续利用的特点[1]。松针利用历史悠久,《本草纲目》记载:“松针气味苦、温、无毒,主治风湿痔疮,生毛发、安五脏、守中、不饥荒年”[2],具有镇静、镇痛、抗炎、解热等临床药理作用[3]和增强免疫力、降血脂、抗衰老、抗疲劳及抗氧化等多种保健功能[4-5],此外,松针还有较强的的抑菌[6]能力,但研究较少。本文应用响应面方法,采用大肠杆菌抑菌效果为指标,优化了超声波辅助工艺对红松松针抑菌物质提取的条件,为开发红松松针为原料的抑菌剂提供理论依据。
红松松针采集于东北林业大学。大肠杆菌为东北林业大学食品微生物实验室保存。
中药粉碎机;电热恒温干燥箱;电子分析天平;旋转蒸发仪;pH计;灭菌锅;无菌操作台;恒温振荡器;恒温培养箱;超声波清洗器。
1.3.1 原料预处理。将红松松针洗净后,放置于干燥箱中烘干,用中药粉碎机粉碎并过60目筛,用1∶40石油醚浸泡24h脱去粗脂肪,烘干后备用。
1.3.2 抑菌圈的测定。将提取液旋转蒸发去除溶剂后定容至50mL。采用滤纸片扩散法测定抑菌圈的大小,向90mm培养皿中倒入20mL已灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基,待其凝固后,加入100μL菌液,涂布均匀,静置5min。滤纸片打成直径6mm的圆片,灭菌。将含有10μL提取液的的滤纸片置于培养皿表面。培养皿于37℃培养24h,用游标卡尺测量抑菌圈大小[7]。
1.3.3 抑菌活性单因素试验。抑菌活性测定单因素试验包括乙醇浓度、料液比、超声时间、提取温度,乙醇浓度(A):40%、50%、60%、70%、80%,料液比(B):20、30、40、50、60mL/g,超声时间(C):10、20、30、40、50min,提取温度(D):30、40、50、60、70℃。每个因素进行3次重复试验,选用平均值作为参数,确定各因素对结果的影响。
表1 红松松针提取物对大肠杆菌抑菌活性单因素试验表
1.3.4 抑菌活性响应面试验。在单因素试验的基础上,根据Design-Expert 8.0软件,Box-Behnken设计响应面试验,并用SAS9.0统计分析软件对4因素3水平的响应面结果进行分析。试验因素水平见表2。
表2 响应面试验因素与水平
2.1.1 乙醇浓度对抑菌效果的影响。由图1可知,提取液中乙醇含量从40%逐渐增加时,析出的松针抑菌物质量也逐渐增多,抑菌圈直径显示出增大现象;而乙醇浓度为50%是一个临界条件,再继续增大,抑菌圈直径降低。
图1 乙醇浓度对松针抑菌物质提取的影响
2.1.2 料液比对抑菌效果的影响。由图2可知,料液比依次增大,抑菌圈直径先增大最后平稳略下降。横坐标的料液比为50mL/g时,纵坐标的抑菌圈直径最大,为9.12mm。当料液比达到50mL/g时,松针抑菌物溶出量达到顶峰,不再溶出,抑菌圈直径呈现平稳状态。
图2 料液比对松针抑菌物质提取的影响
2.1.3 超声时间对抑菌效果的影响。由图3可知,超声时间增加,抑菌圈直径先增大后减小。当为30min时,抑菌圈直径最大,为9.24mm。
图3 超声时间对松针抑菌物质提取的影响
2.1.4 提取温度对抑菌效果的影响。由图4可知,提取温度增加,抑菌圈直径先增大后减小。当为50℃时,抑菌圈直径最大,为9.11mm。提取温度50℃是一个临界条件。
图4 提取温度对松针抑菌物质提取的影响
表3 响应面设计及试验结果
根据表2安排试验,对试验结果回归拟合所得回归模型如下:y=9.75+0.065×A+0.32×B+0.24×C+0.16×D-0.048×A+0.088×A×C+0.056×A×D+0.14×B×C+0.097×B×D-0.057×C×D-0.58×A2-0.30×B2-0.72×C2-0.64×D2
由表3、4可知,失拟项P=0.6317>0.05,表明模型与实际值之间具有较好的拟合度;模型的P<0.0001,说明模型具有极高的显著度;模型的决定系数R2=0.9032,AdjR2=0.8129,说明预测值与实测值之间具有较好的拟合度,表明模型的可靠性高。
表4 响应面二次模型方差分析
由图5可知,影响红松松针抑菌物对大肠杆菌抑菌效果的因素顺序为:B>C>D>A,即影响最大的是料液比,其次是提取时间。此回归模型的最优结果为乙醇浓度50.55%,料液比56.05mL/g,超声时间32.19min,提取温度51.60℃,在此条件下对应的响应值R的最大值为9.89mm,即最大的抑菌圈直径为9.89mm。考虑仪器设备及相关条件,确定最优工艺参数值为乙醇浓度50%,料液比56mL/g,超声时间30min,提取温度50℃,在此工艺条件进行3次平行试验,得到的抑菌圈大小为(9.78±0.14)mm。
本试验研究超声波辅助对红松松针抑菌物进行提取,运用了滤纸片法测定大肠杆菌抑菌圈大小作为研究指标,并用响应面法进行了优化。经过综合考虑后最佳工艺条件为乙醇浓度50%,料液比56mL/g,超声时间30min,提取温度50℃。试验结果表明,适宜提取条件下,红松松针抑菌物对大肠杆菌具有良好的抑菌活性,其作为植物源抑菌剂可能具有良好的开发前景,但其抑菌活性成分还有待进一步的研究。
图5 两因素交互作用对红松松针抑菌物质提取效果影响的响应面图
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