平欧回交榛快繁体系建立研究初探

周建宇，贾鹏博，姜秀煜

(黑龙江省带岭林业科学研究所，黑龙江 伊春 153106)

平欧回交榛，是以平欧杂种榛为母本，平榛(CorylusheterophyllaFisch)为父本进行回交选育出的优良抗寒品种，平欧杂种榛是以中国平榛为父本，与引入我国的欧洲榛(C.avellanaL.)为母本种间远缘杂交选育出的品种。由于选育出的优良回交榛数量少，用常规手段大量繁育无性系苗木是十分困难的，因此，为了得到大量的优质的平欧回交榛幼苗必须依靠无性繁殖技术，植物组织培养已经逐渐成为一些经济作物、果树的主要繁殖方式，因此本实验选取优良平欧回交榛萌条为外植体，探索建立平欧回交榛快繁体系的适宜条件，为其组培苗的工厂化生产提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

5月中旬在试验地采集优良平欧回交榛萌条，每个萌条带腋芽10余个，长度为30～40cm，进行水培，3～6天叶芽膨大，筛选合适的外植体进行组培。

1.2 方法

1.2.1 材料表面消毒处理。采用3种消毒处理方法，将外植体先用软毛刷轻轻刷洗，流水下冲洗1h，转移到无菌操作台上，用75%酒精浸泡30s，然后用无菌水冲洗3～5次，再分别在5%NaClO和0.1%HgCl2中浸泡8～10min(见表1)，不断搅拌，用无菌水冲洗3次，每次持续90s，将消毒后的茎段置于无菌滤纸上，吸干水分，接种到培养基上，每个处理接种10个外植体，每瓶接种1个外植体，重复3次，第7天观察污染率和发芽率。第30d统计成活率。污染率=(被污染的外植体数/接种的外植体总数)×100%；发芽率=(未污染外植体芽萌发个数/接种的外植体总数)×100%；成活率=(存活外植体数/接种的外植体总数)×100%。

表1 不同灭菌处理

1.2.2 基础培养基筛选。以MS培养基、DKW培养基、WPM培养基3种培养基为基础培养基，分别在培养基中加入2mg/L 6-BA，0.0015mg/L NAA，0.3mg/L GA3，将已经灭菌的茎段剪成1～2cm，每个茎段上带一个叶芽，接种到上述三种基础培养基中。培养基中含琼脂0.6%，蔗糖含量3.0%，pH5.5。每个处理接种10个外植体，每瓶接种1个外植体，重复3次，每天记录外植体生长情况，连续观察30d。诱导率=(有不定芽产生的接种外植体数/接种的外植体总数)×100%。

1.2.3 增殖培养基的筛选。将在基础培养基上诱导出新的芽苗分别接种到DKW+1.5mg/L 6-BA+0.01/L IBA+0.1%PVP和DKW+3mg/L 6-BA+0.05 mg/L IBA+0.1% PVP培养基上进行增殖培养，30d后观察榛子组培苗的增殖情况。每个处理接种10个外植体，每瓶接种1个外植体，重复3次，增殖率=(增殖后芽苗的个数/接种芽苗的个数)×100%。

2 结果与分析

2.1 外植体灭菌

表2 不同灭菌处理对茎段污染率、发芽率和成活率的影响

结果表明(见表2)，不同灭菌剂和灭菌时间处理对平欧回交榛灭菌效果的影响存在很大差别。说明平欧回交榛的外植体灭菌应综合考虑灭菌剂和灭菌时间，才有助于提高外植体的成活率。其污染率(%)的结果如下，处理1>处理2>处理3，对发芽率(%)及成活率(%)的影响结果为：处理3>处理2>处理1。用0.1%HgCl2消毒5min，用无菌水冲洗3次，继续用0.1%HgCl2消毒3min时的平均发芽率以及平均成活率最高，且平均污染率最低。故本实验条件下灭菌效果最好的处理是3号，其外植体污染率为50%，发芽率为69%，成活率为45%。

2.2 基础培养基的筛选

在建立平欧回交榛组培快繁体系时，选择合适的培养基是组织培养成功的前提。本次试验选择MS培养基、DKW培养基、WPM培养基3种培养基为基础培养基，观察平欧回交榛在3种基础培养基上的生长情况。根据试验结果(见表3)，平欧回交榛在DKW培养基中的诱导率与WPM及MS培养基上比较差异较大，大于WPM培养基和MS培养基，其诱导率达到60%。

表3 不同培养基对芽生长的影响

2.3 增殖培养基的筛选

在基本培养基确定的前提下，筛选合适的激素种类和激素配比是组培成功与否的重要因素。试验结果表明(见表4)，在DKW+3mg/L 6-BA+0.05mg/L IBA+0.1%PVP培养基上进行增殖培养的芽苗增殖率达到210%，叶大而绿，增殖的苗茎粗壮，生长情况良好。

表4 不同浓度激素组合对芽增殖的影响

3 讨论

本实验采用平欧回交榛萌条茎段作为外植体，为了获得无菌材料，在接种之前必须经过灭菌处理。不同灭菌剂和灭菌时间的差别是很大的，选择合适的灭菌剂和处理时间可以降低外植体的污染率，提高外植体的成活率。本试验用0.1%HgCl2消毒5min，用无菌水冲洗3次，继续用0.1%HgCl2消毒3min，其外植体污染率为50%，发芽率为69%，成活率为45%。

培养基是植物组织培养的物质基础，通过对基础培养基的选择试验发现，采用DKW+2mg/L 6-BA+0.0015mg/L NAA +0.3mg/L GA3培养基对平欧回交榛的诱导率达到60%；除了基础培养基外，激素的种类和质量浓度搭配也是很关键的因素，本试验中，在DKW+3mg/L 6-BA+0.05mg/L IBA+0.1%PVP培养基上进行增殖培养的芽苗增殖率达到210%，叶大而绿，增殖的苗茎粗壮。

但平欧回交榛组培苗在生长30d后生长迹象出现褐化现象，考虑榛属植物中酚类物质含量较高，易出现外植体和培养物的褐化、枯死现象，它对其快繁体系建立能否成功起到决定性的作用，因此榛属植物组织培养体系的建立比较困难，在今后的试验中，在培养基中加入抗酚类氧化的药剂，继续探索平欧回交榛的组培扩繁生根试验，将榛子的组培繁苗生根试验进一步完善。

图1 平欧回交榛初代培养

图2 平欧回交榛的初代培养

图3 平欧回交榛的继代培养