液相色谱法测定乳饮料中阿司帕坦含量的不确定度分析

嘉琦

(北京市理化分析测试中心，北京市食品安全分析测试工程技术研究中心，北京市科学技术研究院分析测试技术重点实验室，北京 100089)

测量不确定度描述了测量结果的可疑程度，是表征被测定值的分散性的参数[1,2]，其数值的大小反映了测量结果质量的高低，并直接与检验结果的合格判定相关。《实验室资质认定评审准则》中规定：在不确定度与检测结果的有效性或应用有关，或客户有要求，或不确定度影响到对结果符合性的判定时，检测报告必须包括不确定度的信息[3]。阿司帕坦即天门冬酰苯丙胺酸甲酯, 又称阿斯巴甜或甜味素,具有甜度高、热量低等特点，是一种被广泛应用的人工甜味剂[4，5]。然而，阿司帕坦的安全性一直存在着较大争议[6-8],我国GB 2760—2011[9]《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中规定了阿司帕坦在乳饮料中的最大用量为0.6 g/kg。目前阿司帕坦的检测方法较为成熟[10-16]，但相关的不确定度分析确鲜有报道[17]，而液相色谱法测定乳饮料中阿司帕坦含量的相关研究基本空缺。

本文参照JJF 1135—2005《化学分析测量不确定度评定》[18]和JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》，按照GB/T 22254—2008《食品中阿司帕坦的测定》[19]，利用液相色谱法测定乳饮料中阿司帕坦的含量，根据数学模型对各影响分量的不确定度分别进行评估，评定乳饮料中阿司帕坦测定的不确定度[20-24]，为实验室质量控制提供了科学、准确的依据，同时为其他食品添加剂测定的不确定度评定提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Alliance 2695液相色谱仪(配有二极管阵列检测器)，美国Waters 公司；BS224S型电子天平,德国sartorius公司；Milli-Q Acadaemic型超纯水仪,美国Millipore公司；CR22GⅢ型离心机，日本日立公司；色谱纯甲醇、乙醇，美国Fisher公司；阿司帕坦标准品，德国Dr.Ehrenstorfer公司，纯度99.0%。

1.2 色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5μm) ；流动相：甲醇+水(39+61)；流速：0.8 mL/min；二极管阵列检测器，检测波长208nm；进样体积：10 μL；柱温：30℃。

1.3 前处理过程

称取约5 g试样(精确到0.001 g)，于50mL离心管，加入10mL乙醇，颠倒数次(不能振摇)，静置1min，4000 r/min离心5min，上清液滤入25ml容量瓶，沉淀用5mL乙醇+水(2+1)洗涤，离心后合并上清液，用乙醇+水(2+1)定容至刻度，过滤后上机测定。

1.4 标准溶液的配制

准确称取阿司帕坦固体标准品100.0mg，置于100 mL容量瓶中，用二次水溶解并定容至刻度，得1.00mg/mL阿司帕坦标准储备液。

准确移取10 mL标准储备液，置于100mL容量瓶中，用二次水溶液溶解并定容至刻度，得100 mg/L标准使用液。

准确移取5 mL100 mg/L标准使用液，置于10mL容量瓶中，用二次水溶液溶解并定容至刻度，得50 mg/L标准使用液。

准确移取2.5 mL1.0 mg/mL标准储备液，置于100mL容量瓶中，用二次水溶液溶解并定容至刻度，得25 mg/L标准使用液。

分别准确移取6.0 mL和2 mL25 mg/L标准使用液，置于两个10mL容量瓶中，用二次水溶液溶解并定容至刻度，得15 mg/L和5 mg/L标准使用液。

2 模型建立

2.1 数学模型

式中：

X：样品中阿司帕坦的含量(g/kg)；

C：由标准曲线计算出进样液中阿司帕坦的浓度(μg/mL)；

V：样品溶液定容体积(mL)；

f：样品溶液稀释倍数；

m：样品的质量(g)。

2.2 不确定度分量的主要来源

经分析可知，不确定度分量的主要来源是配制标准溶液产生的不确定度ur(Cs)、拟合工作曲线过程中产生的不确定度ur(Cpred)、样品称量的不确定度ur(m)、样品前处理定容时产生的不确定度ur(V)和测量重复性产生的不确定度ur(Xpred)。

3 不确定度的评定

3.1 配制标准溶液产生的不确定度ur(Cs)

3.1.1 固体标准品产生的相对标准不确定度ur(S)

阿司帕坦固体标准品的纯度为99%，不确定度为0.5%，包含因子k=2，则阿司帕坦标准品产生的标准不确定度为：u(S)= 0.5%/2=0.0025，相对标准不确定度为：ur(S)=0.0025/99%= 0.0025。

3.1.2 天平称量产生的相对标准不确定度ur(M1)

3.1.3玻璃量器校准引入的相对标准不确定度ur(Vg)

玻璃量器校准引入的不确定度见表1。

表1 玻璃量器校准引入的不确定度

根据表1，合成相对标准不确定度：

3.1.4 标准溶液配制中温度变化产生的不确定度ur(Vt)

表2 温度变化引起的不确定度

根据表2，合成相对标准不确定度：

综合得配制标准储备液的合成相对标准不确定度为：

ur(Cs)=ur(S)2+ur(M1)2+ur(Vg)2+ur(Vt)2-0.0067

3.2拟合工作曲线求Cpred过程中产生的不确定度ur(Cpred)

用液相色谱分别测定系列工作曲线浓度点的强度值，每个浓度点重复测定3次，结果见表3。

表3 工作曲线浓度点对应的响应值

利用表3中的数据，使用线性最小二乘法拟合标准工作曲线，得线性回归方程A= 40415×C-155540 ，相关系数r2= 0.9994 ，斜率a=40415 ，截距b=-155540。由标准工作曲线求Cpred时产生的标准不确定度按下式计算：

u(Cpred)=sa1p+1n+(Cpred-)2∑ni=1(Ci-)2

其中s=∑Ni=1[Ai-(aCi+b)]2n-2,=∑ni=1Cin

式中：

u(Cpred)：绘制标准工作曲线求Cpred时产生的标准不确定度，mg/L；

s：从标准工作曲线求得的强度值与实际测定强度值之差按贝塞尔公式求出的标准偏差；

a、b：分别表示标准工作曲线的斜率(L/mg)、截距；

p：样品重复测定的次数，p= 6；

Cpred：标准工作曲线求出的测试液中阿司帕坦的浓度，mg/L；

Ci：系列标准工作溶液对应的浓度(mg/L)；

Ai：标准溶液峰面积；

n:测定总次数，n=15。

ur(Cpred)=u(Cpred)/Cpred=0.019

3.3 样品称量的相对不确定度ur(m)

电子示天平的分度为0.1mg，k=3，则样品称量的标准不确定度为：

u(m) =0.1/3=0.058mg，相对标准不确定度为：ur(m) =0.058×10-3/5.0000=0.000012

3.4 样品前处理产生的标准不确定度ur(V)

样品前处理产生的不确定度，即定容至25mL容量瓶时产生的不确定度。

3.4.1 玻璃量器校准引起的不确定度ur1(V)

A类25mL容量瓶的最大允许误差为±0.03 mL，按矩形分布考虑，K=3，则用25 mL容量瓶定容产生的相对标准不确定度为：ur1(V2) =0.0325×3= 0.00069。

3.4.2 温度变化引起的不确定度ur2(V)

水的体积膨胀系数(α)为2.1×10-4℃-1, 温度变化按矩形分布计算，k=3，实验室温度在±5℃范围变动，在此范围内，环境温度变化引起的相对标准不确定度ur2(V)=5×2.1×10-4/3=0.00061

因此，定容产生的合成相对不确定度为：

ur(V)=ur1(V)2+ur2(V)2-0.00092。

3.5 测量的重复性产生的相对标准不确定度ur(Xpred)

对实验样品平行测定6次，得到的结果见表4。

表4 重复测定结果

重复测定产生的标准偏差：

s(Xpred)=∑nj=1(Xj-Xpred)2j-1=0.0036 g/kg；

标准不确定度为：

u(Xpred)=s(Xpred)j=0.00366=0.0015 g/kg；

测量重复性产生的相对标准不确定度：

ur(Xpred)=u(Xpred)Xpred=0.00150.118=0.013。

4 相对标准不确定度的合成与扩展

以上所有分量合成的相对标准不确定度为：

Ux/X=ur(Cs)2+ur(Cpred)2+ur(m)2+ur(V)2+ur(Xpred)2

=0.024

取包含因子k=2，则乳饮料中阿司帕坦含量测量结果的扩展不确定度为：

U=k×Ux=2×0.118×0.024=0.006 g/kg

5 结果与讨论

液相色谱法测定乳饮料中阿司帕坦含量，当取样量为5.000 克时，k=2(95%置信度)，测量结果为(0.118±0.006)g/kg。

由计算结果可看出，在液相色谱法测定乳饮料中阿司帕坦含量的过程中，通过对各分量的不确定度评定可知，标准曲线拟合产生的不确定度分量影响最大，其次是重复测量产生的不确定度，实际操作过程中可通过增加混合标准系列工作液测定次数、增加平行样测定次数等方式减小引入的不确定度，从而提高检测质量。

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