磺胺类药物HCD高能裂解与CID裂解的差异性研究

锡全

(1. 北京出入境检验检疫局,北京 100026;2. 国家质检总局国际检验检疫标准与技术法规研究中心,北京 100088)

1 引言

高能诱导裂解技术(Higher energy Collision induced Dissociation，HCD)是一项新型的质谱裂解技术，与离子阱质谱常用的碰撞诱导解离技术(collision induced dissociation，CID)相比，HCD技术提供了稳定的高能裂解方式，并可改善CID裂解中产生的低质量碎片丢失(cut-off)效应，与Orbitrap质量分析器结合还可提供高分辨质谱数据[1-3]。HCD技术在蛋白质、肽段的鉴定和测序领域具有突出优势，在代谢物鉴定、食品添加物分析也有文献报道[1-13]。HCD裂解是通过离子阱进行离子的捕获和选择后，在特定的HCD裂解池中进行高能裂解，经Orbitrap质量分析器得到高分辨的串联质谱图，被称为是一种类三重四极杆模式(triple quadruple like)的裂解技术[4]。

磺胺类(sulphonamides，SAs)是目前广泛应用在畜禽抗感染治疗中的重要药物之一，在家禽养殖业方面，SAs可预防球虫病、霍乱和感染性鼻炎，但SAs有副作用，可导致过敏反应和造血紊乱。国际食品法典委员会(CAC)和许多国家对食品和饲料中的SAs含量作了明确的规定[9, 10]。

有关SAs在三重四级杆和离子阱质谱中的裂解方式已有文献报道[14-22]，但其高能裂解机理还未见报道。本实验通过对SAs药物结构母核鉴定技术的研究，掌握LTQ-Orbitrap XL多级高分辨质谱对药物特征基团的判定在兽药中的应用，对常见的6种SAs在高能裂解池中的裂解规律进行了研究，得到更为丰富的离子信息，并对比了HCD和CID两种裂解模式的差异。同时，通过研究已知SAs的裂解途径和规律，对未知SAs的裂解途径和结构解析研究也有很大的参考和指导作用。为我国的食品安全监控提供定性确证检测手段。

2 实验部分

2.1 仪器和设备

LTQ-Orbitrap XL线性离子阱-轨道离子阱高分辨组合式质谱仪(美国Thermo Fisher公司)，配置电喷雾离子源(ESI源)。

2.2 试剂与材料

所有SAs标准品均购自Dr. Ehrenstorfer公司，纯度均在98%以上。其他试剂均为色谱纯，标准品溶于50%甲醇水溶液。试验用水为Milli-Q超纯水。

2.3 质谱条件

LTQ-Orbitrap XL线性离子阱-轨道离子阱高分辨组合式质谱仪(美国ThermoFisher Scientific公司)，配置电喷雾离子源(ESI源)。ESI正离子模式下蠕动泵直接进样，流速10 μL·min-1。喷雾电压4.5 kV，毛细管温度150℃，壳气流速10 arb，HCD裂解碰撞气为高纯氮气，HCD归一化碰撞能量55.0%。CID裂解碰撞气为高纯氦气，CID归一化碰撞能量55.0%。

3 结果与讨论

3.1 磺胺胍

英文名称：sulfaguanidne monohydrate

结构式：

分子量：214.05245，母离子：[M+H]+=215.05972

对[M+H]+进行二级质谱扫描(HCD)，m/z215.05965是[M+H]+峰，在分辨率为30,000时高分辨质谱测得的质量误差为-0.33mg/kg，符合最新的欧盟(SANCO/10684/2009)化合物确证指令。碎片离子m/z156.01122、m/z108.04418、m/z92.04927和m/z65.03833是磺胺类化合物共有的特征碎片离子。碎片离子m/z156.01122是S-N键断裂后，正电荷保留在含S端而形成的[C6H6NSO2]+；碎片离子m/z108.04418是离子[C6H6NSO2]+再失去一分子SO后产生的[C6H6NO]+；碎片离子m/z92.04927则是离子[C6H6NSO2]+失去一分子SO2产生的[C6H6N]+；碎片离子m/z65.03833则是离子[C6H6N]+裂解产生的[C5H5]+。推导裂解途径如图1。

当HCD和CID的碰撞能量均为55%时，CID裂解生成碎片离子m/z156.01118。推断其裂解机理为：S-N键断裂，生成[C6H6NSO2]+m/z156.01118。

HCD与CID相比(图2)，具有共同的碎片离子峰m/z156.01138，都是在-SO2-基团两端进行的裂解。除此之外，HCD还生成了m/z108.04418、m/z92.04927和m/z65.03833碎片离子。在相同碰撞能量的CID模式下，未得到这些离子碎片，且HCD谱图更为直观清晰。

图1 磺胺胍的HCD质谱裂解途径

图2 磺胺胍在HCD(A)与CID(B)模式下的质谱图比较(碰撞能量：55%eV)

3.2 磺胺吡啶

英文名称：sulfapyridine

结构式：

分子量：249.05720，母离子：[M+H]+=250.06447

对[M+H]+进行二级质谱扫描(HCD)，m/z250.06444是[M+H]+峰，在分辨率为30,000时高分辨质谱测得的质量误差为-0.12mg/kg，符合最新的欧盟(SANCO/10684/2009)化合物确证指令。碎片离子m/z156.01111、m/z108.04418、m/z92.04925和m/z65.03830是磺胺类化合物共有的特征碎片离子。碎片离子m/z156.01111是S-N键断裂后，正电荷保留在含S端而形成的[C6H6NSO2]+；碎片离子m/z108.04418是离子[C6H6NSO2]+再失去一分子SO后产生的[C6H6NO]+；碎片离子m/z92.04925则是离子[C6H6NSO2]+失去一分子SO2产生的[C6H6N]+；碎片离子m/z65.03830则是离子[C6H6N]+裂解产生的[C5H5]+。除上述共有的特征碎片离子外，磺胺吡啶还产生了其他丰度较高的碎片离子，这些碎片离子反应了R基的取代信息：离子碎片m/z95.06021是S-N键断裂后失去C6H5NO2S，正电荷保留在含N端产生的[C5H7N2]+；离子碎片m/z184.08679是S-N键和C-S键同时断裂，失去HSO2，发生偶氮反应形成的[C11H10N3]+。推导裂解途径如下(图3)：

当HCD和CID的碰撞能量均为55%时，CID裂解主要生成碎片离子m/z156.01141、m/z184.08696和m/z108.04425。推断其裂解机理为：S-N键断裂，生成[C6H6NSO2]+m/z156.01138；碎片离子m/z156.01161失去一分子SO或SO2产生的[C6H6NO]+m/z108.04424。

HCD与CID相比(图4)，具有共同的碎片离子峰m/z156.01138、m/z184.08692和m/z108.04439，都是在-SO2-基团两端进行的裂解。除此之外，HCD还生成了m/z95.06021、m/z92.04925和m/z65.03830碎片离子+。在相同碰撞能量的CID模式下，未得到该离子碎片，且HCD谱图更为直观清晰。

图3 磺胺吡啶的HCD质谱裂解途径

图4 磺胺吡啶在HCD(A)与CID(B)模式下的质谱图比较(碰撞能量：55%eV)

3.3 磺胺嘧啶

英文名称：sulfadiazine

结构式：

分子量：250.05245，母离子：[M+H]+=251.05972

对[M+H]+进行二级质谱扫描(HCD)，m/z251.05998是[M+H]+峰，在分辨率为30,000时高分辨质谱测得的质量误差为1.0mg/kg，符合最新的欧盟(SANCO/10684/2009)化合物确证指令。碎片离子m/z156.01140、m/z108.04433、m/z92.04939和m/z65.03832是磺胺类化合物共有的特征碎片离子。碎片离子m/z156.01140是S-N键断裂后，正电荷保留在含S端而形成的[C6H6NSO2]+；碎片离子m/z108.04433是离子[C6H6NSO2]+再失去一分子SO后产生的[C6H6NO]+；碎片离子m/z92.04939则是离子[C6H6NSO2]+失去一分子SO2产生的[C6H6N]+；碎片离子m/z65.03832则是离子[C6H6N]+裂解产生的[C5H5]+。除上述共有的特征碎片离子外，磺胺嘧啶还产生了其他丰度较高的碎片离子，这些碎片离子反应了R基的取代信息：离子碎片m/z96.05553是S-N键断裂后失去C6H5NO2S，正电荷保留在含N端产生的[C4H6N3]+；离子碎片m/z158.00177是C-S键断裂后，正电荷保留在含S端生成的[C4H4N3O2S]+；而离子碎片m/z185.08226则是S-N键和C-S键同时断裂，失去HSO2，发生偶氮反应形成的[C10H9N4]+。推导裂解途径如下(图5)：

图5 磺胺嘧啶的HCD质谱裂解途径

当HCD和CID的碰撞能量均为55%时，CID裂解主要生成碎片离子m/z156.01160、m/z108.04440、m/z158.00204、m/z92.04945和m/z185.08234。推断其裂解机理为：S-N键和C-S键同时断裂，失去HSO2，发生偶氮反应形成[C10H9N4]+m/z185.08234；C-S键断裂生成[C4H4N3O2S]+m/z158.00204；S-N键断裂，生成[C6H6NSO2]+m/z156.01161；而碎片离子m/z156.01161失去一分子SO或SO2产生的[C6H6NO]+m/z108.04431和[C6H6N]+m/z92.04938。

HCD与CID相比(图6)，具有共同的碎片离子峰m/z185.08217、m/z158.00187、m/z156.01138、m/z108.04439和m/z92.04948，都是在-SO2-基团两端进行的裂解。除此之外，HCD还生成了m/z96.05553和m/z65.03838等离子。在相同碰撞能量的CID模式下未得到这些离子碎片，且HCD谱图更为直观清晰。

图6 磺胺嘧啶在HCD(A)与CID(B)模式下的质谱图比较(碰撞能量：55%eV)

3.4 磺胺甲基异噁唑

英文名称：sulfamethoxazole

结构式：

分子量：253.05211，母离子：[M+H]+=254.05939

对[M+H]+进行二级质谱扫描(HCD)，m/z254.05916是[M+H]+峰，在分辨率为30,000时高分辨质谱测得的质量误差为-0.90mg/kg，符合最新的欧盟(SANCO/10684/2009)化合物确证指令。碎片离子m/z156.01115、m/z108.04415、m/z92.04924和m/z65.03820是磺胺类化合物共有的特征碎片离子。碎片离子m/z156.01115是S-N键断裂后，正电荷保留在含S端而形成的[C6H6NSO2]+；碎片离子m/z108.04415是离子[C6H6NSO2]+再失去一分子SO后产生的[C6H6NO]+；碎片离子m/z92.04924则是离子[C6H6NSO2]+失去一分子SO2产生的[C6H6N]+；碎片离子m/z65.03820则是离子[C6H6N]+裂解产生的[C5H5]+。除上述共有的特征碎片离子外，磺胺甲基异噁唑还产生碎片离子m/z99.05528，该碎片离子反应了R基的取代信息：是S-N键断裂后失去C6H5NO2S，正电荷保留在含N端产生的[C5H8N3]+。推导裂解途径如图7。

图7 磺胺甲基异噁唑的HCD质谱裂解途径

当HCD和CID的碰撞能量均为55%时，CID裂解主要生成碎片离子m/z156.01122、m/z188.08170和m/z108.04417。推断其裂解机理为：S-N键断裂，生成[C6H6NSO2]+m/z156.01138；碎片离子m/z156.01161失去一分子SO产生的[C6H6NO]+m/z108.04424；S-N键和C-S键同时断裂，失去HSO2，发生偶氮反应形成[C10H10N3O]+m/z188.08170。

HCD与CID相比(图8)，具有共同的碎片离子峰m/z156.01138和m/z108.04439，都是在-SO2-基团两端进行的裂解。除此之外，HCD还生成了m/z99.0552、m/z92.04924和m/z65.03820碎片离子。在相同碰撞能量的CID模式下，未得到该离子碎片。另外，CID还产生碎片离子m/z188.08170。(图8)

3.5 磺胺噻唑

英文名称：sulfathiazole

结构式：

分子量：255.01362，母离子：[M+H]+=256.02089

对[M+H]+进行二级质谱扫描(HCD)，m/z256.02075是[M+H]+峰，在分辨率为30,000时高分辨质谱测得的质量误差为-0.55mg/kg，符合最新的欧盟(SANCO/10684/2009)化合物确证指令。碎片离子m/z156.01132、m/z108.04430、m/z92.04937和m/z65.03827是磺胺类化合物共有的特征碎片离子。碎片离子m/z156.01137是S-N键断裂后，正电荷保留在含S端而形成的[C6H6NSO2]+；

图8 磺胺甲基异噁唑在HCD(A)与CID(B)模式下的质谱图比较(碰撞能量：55%eV)

碎片离子m/z108.04431是离子[C6H6NSO2]+再失去一分子SO后产生的[C6H6NO]+；碎片离子m/z92.04940则是离子[C6H6NSO2]+失去一分子SO2产生的[C6H6N]+；碎片离子m/z65.03831则是离子[C6H6N]+裂解产生的[C5H5]+。除上述共有的特征碎片离子外，磺胺甲基嘧啶还产生碎片离子m/z101.01657，该碎片离子反应了R基的取代信息：是S-N键断裂后失去C6H5NO2S，正电荷保留在含N端产生的[C3H5N2S]+。推导裂解途径如图9。

当HCD和CID的碰撞能量均为55%时，CID裂解主要生成碎片离子m/z156.01157和m/z108.04424。推断其裂解机理为：S-N键断裂，生成[C6H6NSO2]+m/z156.01138；碎片离子m/z156.01161失去一分子SO产生[C6H6NO]+m/z108.04424。

图9 磺胺噻唑的HCD质谱裂解途径

HCD与CID相比(图10)，具有共同的碎片离子峰m/z156.01138和m/z108.04439，都是在-SO2-基团两端进行的裂解。除此之外，HCD还生成了m/z101.01657、m/z92.04937和m/z65.03827碎片离子。在相同碰撞能量的CID模式下，未得到该离子碎片，且HCD谱图更为直观清晰。

图10 磺胺噻唑在HCD(A)与CID(B)模式下的质谱图比较(碰撞能量：55%eV)

3.6 磺胺甲基嘧啶

英文名称：sulfamerazine

结构式：

分子量：264.06810，母离子：[M+H]+=265.07537

对[M+H]+进行二级质谱扫描(HCD)，m/z265.07547是[M+H]+峰，在分辨率为30,000时高分辨质谱测得的质量误差为0.39mg/kg，符合最新的欧盟(SANCO/10684/2009)化合物确证指令。碎片离子m/z156.01137、m/z108.04431、m/z92.04940和m/z65.03831是磺胺类化合物共有的特征碎片离子。碎片离子m/z156.01137是S-N键断裂后，正电荷保留在含S端而形成的[C6H6NSO2]+；碎片离子m/z108.04431是离子[C6H6NSO2]+再失去一分子SO后产生的[C6H6NO]+；碎片离子m/z92.04940则是离子[C6H6NSO2]+失去一分子SO2产生的[C6H6N]+；碎片离子m/z65.03831则是离子[C6H6N]+裂解产生的[C5H5]+。除上述共有的特征碎片离子外，磺胺甲基嘧啶还产生了其他丰度较高的碎片离子，这些碎片离子反应了R基的取代信息：离子碎片m/z110.07117是S-N键断裂后失去C6H5NO2S，正电荷保留在含N端产生的[C5H8N3]+；离子碎片m/z172.01747是C-S键断裂后，正电荷保留在含S端生成的[C5H6N3O2S]+；而碎片离子m/z190.02812则是离子m/z172.01747经分子离子反应，加合一分子H2O后形成的[C5H6N3O2S·H2O]+。推导裂解途径如图11。

当HCD和CID的碰撞能量均为55%时，CID裂解主要生成碎片离子m/z156.01138、m/z172.01755、m/z190.02803、m/z110.07116、m/z108.04424和m/z92.04929。推断其裂解机理为：C-S键断裂生成[C5H6N3O2S]+m/z172.01755，再经分子离子反应，加合一分子H2O后形成离子[C5H6N3O2S·H2O]+m/z190.02803；S-N键断裂，生成[C6H6NSO2]+m/z156.01138和[C5H8N3]+m/z110.07116；碎片离子m/z156.01161失去一分子SO或SO2产生的[C6H6NO]+m/z108.04424和 [C6H6N]+m/z92.04929。

图11 磺胺甲基嘧啶的HCD质谱裂解途径

HCD与CID相比(图12)，具有共同的碎片离子峰m/z156.01138、m/z172.01752、m/z190.02809、m/z110.07127、m/z108.04439和m/z92.04948，都是在-SO2-基团两端进行的裂解。除此之外，HCD还生成了m/z65.03831碎片离子，它是离子m/z92.04939裂解产生的[C5H5]+。在相同碰撞能量的CID模式下，未得到该离子碎片，且HCD谱图更为直观清晰。

图12 磺胺甲基嘧啶在HCD(A)与CID(B)模式下的质谱图比较(碰撞能量：55%eV)

4 结论

磺胺类药物是一类传统的合成抗菌药物，因其具有对氨基苯磺酰胺结构，在ESI正离子模式中产生[M+H]+分子离子，在HCD裂解过程中以-SO2-NH-基团为中心，发生S-N键的断裂，并伴随着重排，产生特征离子m/z156.01138、m/z108.04439、m/z92.04948和m/z65.03858。另外磺胺类药物还发生C-S键的断裂。HCD二级质谱产生的特征碎片离子可作为磺胺类药物的判断依据，而通过R基团断裂的碎片离子峰可以推测取代基的结构。与CID相比，HCD技术提供了稳定的高能裂解方式，并可改善CID裂解中产生的cut-off效应。HCD裂解模式结合高分辨质谱数据，为推测化合物结构、质谱裂解机理等提供更为详实的裂解碎片信息，为化合物的确证提供可靠的理论依据。该质谱裂解规律可以应用于磺胺及其类似物的质谱分析，对磺胺及其类似物的快速筛选鉴别、定量分析和药动学研究起到一定的参考作用。

[1] 张娟. 磺胺二甲氧嘧啶钠在斑点叉尾鮰体内毒性及代谢的研究. 学位论文. 华中农业大学 水产品加工及贮藏工程 2010.

[2] 彭金友. 肾毒性抗菌素. 海峡药学 2000,(12): 83.

[3] 谢秀琼. 复方磺胺甲唑片致肾脏毒性1例. 海峡药学 2000, (12): 76.

[4] 杨俊超. 磺胺类药物过敏诊治方案. 中国全科医学 2005, 8(11): 935.

[5]林海丹, 谢守新, 冯德雄，等. 动物源性食品中磺胺类药物残留的固相萃取-高效液相色谱法测定. 分析测试学报 2003, 22(1): 94-96.

[6] Kishida K, Furusawa N. Matrix solid-phase dispersion extraction and high-performance liquid chromatographic determination of residual sulfonamides in chicken. Journal of Chromatography A, 2001, 937(1-2): 49-55.

[7]Sergi M, Gentili A, Perret D, et al. MSPD extraction of sulphonamides from meat followed by LC tandem MS determination. Chromatographia, 2007, 65(11-12): 757-761.

[8] 李存, 王战辉, 石玉祥，等. 免疫亲和色谱-液相色谱-串联质谱法同时检测动物肌肉组织中喹诺酮类和磺胺类药物残留. 2008年京津冀畜牧兽医科技创新交流会暨新思想、新观点、新方法论坛论文集2008：457-464.

[9] 龚明辉. 免疫亲和色谱-高效液相色谱法检测鸡肌肉中的3种磺胺类药物. 福建省畜牧兽医学会2009年学术年会论文集 2009： 26-29.

[10]Arancibia V, Valderrama M, Rodriguez P,et al. Quantitative extraction of sulfonamides in meats by supercritical methanol-modified carbon dioxide: A foray into real-world sampling. Journal of Separation Science,2003, 26(18): 1710-1716.

[11]卢立泓, 陶建伟, 蔡蒲，等. 微波萃取鳗鱼中磺胺类药物的HPLC测定方法. 现代科学仪器，2005,(1): 57-59.

[12] 耿士伟, 曲斌, 姜加华，等. QuEChERS-UPLC-MS/MS快速测定鸡肝中七种磺胺类药物残留. 中国兽药杂质，2011, (10): 16-19.

[13] 董静, 宫小明, 张立，等. QuEChERS-高效液相色谱法同时检测动物组织中的克球酚、地克珠利和磺胺类药物残留量. 中国卫生检验杂志，2008, 18(1): 26-28.

[14] Msagati T A M, Nindi M. M. Multiresidue determination of sulfonamides in a variety of biological matrices by supported liquid membrane with high pressure liquid chromatography-electrospray mass spectrometry detection. Talanta, 2004, 64(1): 87-100.

[15]Roybal José E, Pfenning Allen P, Turnipseed Sherri B.et al. Application of size-exclusion chromatography to the analysis of shrimp for sulfonamide residues. Analytica Chimica Acta, 2003, 483(1-2): 147-152.

[16]Barham R, Black W D, Claxton J, et al, Rapid ashy for detecting sulfonamidesin tissues of slaughtered animals. J Food Protection， 2001, 64(10): 1565-1573.

[17] 刘雪红, 李 娟, 董紫凌，等. 鸡肉中磺胺类药物残留的薄层色谱检测方法.中国畜牧兽医，2007, 34(5): 31-33.

[18] Giovanardi C, Barbieri L， Tantillo M G. Determination of Sulfonamide Residues in Raw Hams. Industrie Alimentari， 1994, 33(329): 828-832

[19] 赵晓凤, 杨 中. 气相色谱-串联质谱法检测猪肉组织中的磺胺二甲嘧啶残留量. 饲料工业，2007, 28(2): 54-57.

[20] Reeves V B. Confirmation of multiple sulfonamide residues in bovine milk by gas chromatography-positive chemical ionization mass spectrometry. Journal of Chromatography B， 1999, 723(1-2): 127-137.

[21] Tarbin J A, Clarke P， Shearer G. Screening of sulphonamides in egg using gas chromatography-mass-selective detection and liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography B， 1999, 729(1-2): 127-138.

[22] 李存, 江海洋, 吴银良，等. 高效液相色谱-荧光-紫外法测定动物肌肉组织中多类药物残留. 分析化学，2009, 37(8): 1102-1106.