浅谈生物种质资源保存技术和方法

王立辉

（西藏自治区高原生物研究所，西藏 拉萨 850008）

1 植物种子保存技术

1.1 技术原理

种子保存采用国际生物多样性组织推荐的种子保存方法，即在相对湿度10-15%和10-20℃的温度下将种子干燥至水分含量5%左右，然后将种子密封在容器内（以保持它们的水分含量），储藏在-18℃或更低的温度下［2-3］。

1.2 技术路线

种子保存的技术主要步骤包括种子的采集（采集、记录、标本收集等）、前期处理（初步干燥、清除杂物，包括去果皮、果翅、坏空种子等）、干燥、入库保存、库存种子活力检测、复壮等，并包括所有有关数据的录入和处理等。

具体步骤：制定采集计划/寻求有关方面的许可、野外采集、迅速运送种子回库、采集数据的计算机录入、初步干燥（15%相对湿度，15℃＞1周）、清理、X-光射线分析、切割试验、种子数量测定、主要干燥（10%相对湿度，18℃＞4周）、封装/入库、初始活力检测、种名证实、送出复份样品、种子的分发、活力复测与复壮（每5年或10年1次）。

2 植物离体保存技术

2.1 技术原理

植物离体保存，是植物种子保存的补充，主要保存对象是种子顽拗型植物、多年生一次性开花植物、多浆植物，其它难以用种子保存的植物，以及采用离体保存比用种子保存更经济有效的植物。例如兰科、天南星科、棕榈科、百合科、龙舌兰科、仙人掌科、杜鹃花科、薯蓣科、景天科、龙胆科以及蕨类植物，大多将采用离体保存的方式进行长期有效的保存。植物离体材料是可供繁殖使用的非种子材料，包括试管苗、愈伤组织、块根、根孽、块茎、鳞茎、球茎、插条、珠芽、芽、不定芽、芽条、花粉、花药、孢子及其它微繁殖体或培养物。

植物离体材料保存方法主要是常低温保存法、冷冻保存法和-196℃的液氮罐保存法。对于大部分植物离体材料而言，主要采用常低温保存法，而且更新的周期较短，因此，需要设置全自动温室，保证植物离体材料的定期更新。

植物组织培养等生物技术是植物离体保存所采用的主要技术手段，细胞水平和分子水平的手段也是植物离体保存的常规技术。

2.2 技术路线

植物离体种质资源的保存，主要的技术路线：材料的准备（选择适宜的年龄与生长状态）、预处理（如预培养或低温锻炼）、将材料装入试管（插入冰浴中0℃）、加入0℃预冷的冰冻保护剂、慢速（1℃/min）降温到-30℃至-40℃、液氮保存、37℃至40℃水中快速化冻、TTC（检测细胞活力）或再培养、观测（恢复生长速度、生长量、存活率、植株再生、遗传性状分析）。

3 微生物种质资源保存技术

3.1 技术原理

微生物种质资源保存技术主要用于长期、安全、有效地保存大型真菌种质资源，同时适当保存一定数量的放线菌和特殊生境微生物。

在微生物菌种的收集保存中，应根据物种的特性，采用多种保存方法，取长补短，以达到长期、安全、有效地保存种质资源目的。常用的方法有菌种转接法、矿物油保存法、冻干法和液氮保存法等［4］。

3.2 技术路线

技术路线包括微生物种质采集、分离、纯化、分类鉴定、入库保存，定期进行菌种的复壮及活力检测，并建立相应数据库等。具体技术路线详见图1。

图1 微生物种质资源保存技术路线

4 动物种质资源保存技术

4.1 技术原理

动物种质资源主要以保存珍稀濒危特有的野生动物种质资源（精液、卵细胞和胚胎细胞）为主，野生近缘种和特种经济动物的种质资源为辅。有些野生动物的种质资源非常难以收集，这时可以先收集野生动物的组织（特定组织的细胞系或生殖细胞），对组织材料进行低温保存，同时可以对组织细胞建立细胞系或株。动物种质资源以深低温液氮保存为主，作为暂时保存，也可考虑用－80℃冰箱保存［5］。

4.2 技术路线

主要技术路线包括采集、检测活力、降温（不同种质材料选用不同的防冻剂和防冻模式）、液氮保存、定期复苏及活力检测，并在信息系统中输入相应的数据和信息。

采用非损伤性方法，采集不同的动物种质材料，通过液氮深低温冷冻保存方法，长期保存动物种质资源。对不同的种质材料，应采用不同的方法来采集和保存。用注射器抽取血样，全血低温保存；采用耳部打孔办法，采集皮肤样品，建立成纤维细胞，液氮保存；采用电刺激或假阴道法采集精液，用非手术方法采集卵细胞，以合适的防冻液处理，液氮保存。

具体步骤：制定采集、申请许可、野外捕获动物、样品采集(皮肤、血液、生殖细胞）、样品迅速运送到中心库、质量检查、数据录入、样品入库、细胞系建立、低温保存、定期质量控制、样品复份保存、样品的分发和相关研究开发。

5 DNA种质资源保存技术

5.1 技术原理

由于DNA材料的量很小，将采用-80℃的低温冰箱或液氮储藏的方法［6］。

DNA种质资源保存库主要保存无法通过种子库、离体库或微生物种质资源库保存的生物种质材料。DNA的提取、纯化，在收集到组织材料后分步实施。

5.2 技术路线

总DNA保存步骤：种质材料、提取总DNA、检测DNA的纯度及大小、冷冻干燥、-80℃保存/液氮罐。

［1］吕植.西藏生物多样性保护与管理［M］.北京：中国林业出版社，2000：1-2.

［2］张峰，张教洪，闫树林，等.药用植物种质资源保存技术规程［J］.种子，2012，31（9）：69－70.

［3］文彬.植物种质资源超低温保存概述［J］.植物分类与资源学报，2011，33（03）:311-329.

［4］宁国赞.我国农业微生物种质资源收集保藏利用现状及发展前景［A］.第九届全国土壤微生物学术讨论会论文摘要［C］.全国土壤微生物学术讨论会，2001，5.

［5］燕海峰，肖兵南，等.家禽种质资源保存研究［J］.畜禽业，2003（08）:21-23.

［6］房经贵.DNA保存在果树种质资源保存中的利用策略［A］.中国园艺学会.中国园艺学会第四届青年学术讨论会论文集［C］.中国园艺学会，2000:5.