独活寄生汤含药血清对佐剂性关节炎大鼠滑膜成纤维细胞增殖和凋亡的影响

高晓鹏，鲁贵生

新乐市中医医院骨伤二科，河北 新乐 050700

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种以关节滑膜的慢性炎症为主要病变的自身免疫性疾病[1]，滑膜成纤维细胞是导致RA关节软骨破坏的重要细胞之一。活化的滑膜成纤维细胞(FLS)具有永生化、侵袭性、肿瘤样特性，通过形成血管翳直接侵袭关节软骨并可释放大量的促炎因子[2～3]。RA滑膜增生是其主要病理变化，研究发现，这与滑膜成纤维细胞的过度增殖有关，亦与其极低的凋亡率有关，滑膜衬里层成纤维细胞的凋亡率为零，导致滑膜衬里层不断增厚，由正常的1～3层变为5～6层甚至更多，这表明滑膜成纤维细胞增殖与其凋亡减少有关[4]。中医认为，RA属于痹症范畴，独活寄生汤源自唐代孙思邈的《备急千金要方》，由独活、桑寄生、杜仲、牛膝、细辛、秦艽、茯苓、肉桂心、防风、川芎、人参、甘草、当归、芍药、干地黄15味中药组成，具有祛风止痛、补益肝肾气血的功效[5]，临床用于类风湿关节炎常见奇效，但对其具体的治疗机制尚不明确。大鼠佐剂性关节炎模型是一种免疫制剂刺激形成的免疫亢进性关节炎，与人RA的形成及表现有类似之处。本研究通过建立佐剂性关节炎大鼠模型，观察独活寄生汤含药血清对RA-FLS增殖和凋亡的影响，为独活寄生汤治疗RA的作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠，65只，体质量200～220 g，由河北医科大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(冀)2013-1003，合格证编号：1305107。河北医科大学实验动物中心清洁级动物房饲养和实验，温度为22～25℃，自由进食饮水，适应性饲养1周后开始实验。

1.2 主要试剂与仪器 独活寄生汤生药材由本院药剂科提供，经河北医科大学生药学专家赵丁教授鉴定为正品。按原方比例，常规水煎煮3次后将药液合并过滤，60℃水浴浓缩得到总生药浓度为6.0 g/mL药液，4℃保存备用。弗氏完全佐剂购于美国Sigma公司；CCK8试剂盒购于日本同仁；RNA提取试剂及PrimerScriptRT reagent Kit With DNA Eraser试剂盒和PCR所需试剂均购自TaKaRa公司；大鼠Bax、Bcl-2、caspase3 ELISA检测试剂盒购于美国eBioscience；其余试剂均为国产分析级，购于天津大茂。超净工作台、CO2培养箱(日本，三洋公司)；低速离心机(美国Beckman公司)；GeneAmp PCR System 2400型PCR仪(美国ABI公司)；DU730紫外分光光度计(美国Beckman公司)；Synergy HT多功能酶标仪(美国BioTek公司)；Tanon-1600型UVP成像系统(上海天能科技有限公司)。

1.3 模型的建立及含药血清的制备 SD大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常组、模型组、甲氨喋呤组、独活寄生汤高、中、低剂量组，每组10只。除正常组外，其他各组参考文献复制动物模型，造模第1天足跖部皮下注射弗氏完全佐剂0.1 mL，正常组注射相应体积生理盐水[6]。注射后第8天，独活寄生汤高、中、低剂量组分别灌胃独活寄生汤3.0、1.5、0.75 g/kg，甲氨喋呤组每天灌胃甲氨喋呤0.5 g/kg，正常组和模型组给予相应体积生理盐水，每天2次，连续给药20天。末次给药12 h无菌条件下腹主动脉采血，室温静置2 h后，4℃、2 000 rpm离心15 min后取上清，56℃水浴灭活后，-80℃冰箱保存备用。

1.4 滑膜成纤维细胞分组及培养方法 细胞分为6组，滑膜成纤维细胞参考文献通过组织贴壁法[7]获得，分别是空白组、模型组、甲氨喋呤组、独活寄生汤高、中、低剂量组。其中空白组为正常大鼠滑膜成纤维细胞，其余各组均为模型组大鼠滑膜成纤维细胞，空白组和模型组给予20%正常大鼠血清培养；甲氨喋呤组给予20%甲氨喋呤组大鼠含药血清培养；独活寄生汤高剂量组给予20%独活寄生汤高剂量组大鼠含药血清培养；独活寄生汤中剂量组给予20%独活寄生汤中剂量大鼠含药血清培养；独活寄生汤低剂量组给予20%独活寄生汤低剂量大鼠含药血清培养。

1.5 CCK8法检测FLS增殖 使用CCK8试剂盒，按说明书操作，检测细胞增殖率，将上述各组FLS接种于96孔板中，5×103个/孔，每组有5个复孔，分别于培养后的24、48、72 h使用酶标仪测定OD450的A值。增殖抑制率=[(A空白组－A给药组)/A空白组]×100%。

1.6 RT-PCR检测Bax、Bcl-2和caspase3 mRNA的表达 按上述1.4方法获取各组FLS细胞并接种于6孔板中，5×104个/mL，每孔2 mL，继续培养48 h后，分别收集培养上清和细胞，上清用于后续ELISA检测，收集的细胞运用Trizol法提取总RNA。超微量测定仪测定RNA的浓度和纯度，浓度在1.5～2.0 g/L；OD260/OD280在1.8～2.0之间。以获得的RNA为模板，按试剂盒说明书合成cDNA，随后进行PCR扩增，以GAPDH为内参，观察Bax、Bcl-2和caspase3 mRNA表达情况。Bax引物序列如下：上游5′-ATCCCGCCCACTTTCTAC-3′，下游 5′-GCTCAAT CCGTTGTTCAGG-3′；Bcl-2引物序列如下：上游5′-CCTGCCCCAATCCCTTTATT-3′，下游 5′-CCCTAA GCCCCCAATTCTCT-3′；caspase3引物序列如下：上游 5′-TATGCCAACACAGTGTTGTCTGG-3′，下游 5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCACAT-3′；GAPDH 引物序列如下：上游5′-GAAATCCCATCACCATCTTCCAG-3′，下游 5′-GAGCCCCAGCCTTCTCCATG-3′。PCR扩增条件：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环，72℃ 10 min，4℃保存产物。制作标准曲线，根据标准曲线扩增效率的一致性，选用2-△△Ct法分别计算Bax、Bcl-2和caspase3 mRNA的相对表达量。

1.7 ELISA法检测Bax、Bcl-2和caspase3蛋白的表达 将上述1.6中收集的细胞上清，根据ELISA试剂盒说明书，检测各组Bax、Bcl-2和caspase3的表达情况。

1.8 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件对数据进行分析，计量资料以(±s)表示，组间的两两比较用单因素方差分析及LSD法。

2 结果

2.1 各组细胞各时间点增殖抑制率结果比较 见表1。空白组细胞在各时间点未见明显的变化；模型组细胞随时间延长，增殖抑制率升高(P＜0.05)；甲氨喋呤组和独活寄生汤高、中、低剂量组细胞随干预时间的延长，增殖抑制率降低(P＜0.05)。与空白组比较，模型组细胞在各时间点的增殖抑制率均升高(P＜0.05)；与模型组比较，甲氨喋呤组和独活寄生汤各剂量组细胞在各时间点的增殖抑制率均降低(P＜0.05)，尤以高剂量组的降低更为明显。

表1 各组细胞各时间点增殖抑制率结果比较(±s) %

表1 各组细胞各时间点增殖抑制率结果比较(±s) %

与空白组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05；与独活寄生汤低剂量组比较，③P＜0.05；与独活寄生汤中剂量组比较，④P＜0.05；与同组前一时间点比较，⑤P＜0.05

组 别空白组模型组甲氨喋呤组独活寄生汤低剂量组独活寄生汤中剂量组独活寄生汤高剂量组n 5 5 5 5 5 5 2 4 h 2 1.1 7±3.1 3 7 0.2 9±6.5 8①5 6.7 7±8.4 2②6 8.8 7±3.4 2②5 9.1 7±7.8 4②③4 8.6 5±5.5 1②③④4 8 h 1 9.2 0±4.6 3 7 2.2 7±9.1 1①⑤4 8.3 5±6.5 1②⑤6 3.2 9±4.5 6②⑤5 3.2 0±6.3 5②③⑤4 2.1 2±5.5 8②③④⑤7 2 h 1 9.2 4±3.6 2 7 6.4 3±5.0 3①⑤4 2.8 9±2.4 3②⑤6 0.4 5±7.1 6②⑤4 9.4 1±4.3 8②③⑤3 6.0 9±3.2 7②③④⑤

2.2 各组细胞Bax、Bcl-2和caspase3 mRNA表达水平比较 见表2。与空白组比较，模型组Bax、caspase3 mRNA水平降低，Bcl-2 mRNA水平升高(P＜0.05，P＜0.01)。与模型组比较，甲氨喋呤组和独活寄生汤中、高剂量组Bax、caspase3 mRNA水平升高，Bcl-2 mRNA水平降低(P＜0.05，P＜0.01)，高剂量组的作用更为明显。

2.3 各组细胞Bax、Bcl-2和caspase3蛋白表达比较见表3。与空白组比较，模型组Bax、caspase3蛋白含量降低，Bcl-2蛋白含量升高(P＜0.05，P＜0.01)；与模型组比较，甲氨喋呤组和独活寄生汤中、高剂量组Bax、caspase3蛋白含量升高，Bcl-2蛋白含量降低(P＜0.05，P＜0.01)，高剂量组的作用最为明显。

3 讨论

类风湿关节炎主要的病理改变之一是滑膜衬里层的增厚，其主要原因是滑膜成纤维细胞的过度增殖和凋亡的减少。本研究采用弗氏完全佐剂成功建立佐剂性关节炎大鼠模型，分离滑膜成纤维细胞，进而采用独活寄生汤含药血清进行干预，观察其对滑膜成纤维细胞增殖和凋亡的影响，为独活寄生汤用于类风湿关节炎的治疗提供进一步的实验依据。

表2 各组细胞Bax、Bcl-2和caspase3 mRNA表达水平比较(±s)

表2 各组细胞Bax、Bcl-2和caspase3 mRNA表达水平比较(±s)

组 别空白组模型组甲氨喋呤组独活寄生汤低剂量组独活寄生汤中剂量组独活寄生汤高剂量组n 5 5 5 5 5 5 B a x/G A P D H 2.6 4 7±0.1 0 4 1.1 1 7±0.1 2 1②1.8 5 7±0.1 1 2③1.3 5 6±0.0 8 8 1.6 3 1±0.0 9 2③1.9 8 5±0.1 3 4③⑤B c l-2/G A P D H 2.8 9 6±0.1 2 5 3.3 6 7±0.1 3 4①2.5 5 6±0.1 0 1③2.9 7 8±0.0 8 2 2.5 8 6±0.0 9 5③⑤2.4 3 1±0.1 2 1④⑤c a s p a s e 3/G A P D H 3.8 7 3±0.1 6 7 1.9 4 3±0.0 7 8②3.3 6 7±0.1 7 3③2.2 5 3±0.0 9 6 2.9 8 7±0.1 5 8③⑤3.5 6 5±0.0 9 7③⑤

与空白组比较，①P＜0.05，②P＜0.01；与模型组比较，③P＜0.05，④P＜0.01；与独活寄生汤低剂量组比较，⑤P＜0.05

表3 各组细胞Bax、Bcl-2和caspase3蛋白表达比较(±s)ng/mL

表3 各组细胞Bax、Bcl-2和caspase3蛋白表达比较(±s)ng/mL

与空白组比较，①P＜0.05，②P＜0.01；与模型组比较，③P＜0.05，④P＜0.01；与独活寄生汤低剂量组比较，⑤P＜0.05

组 别空白组模型组甲氨喋呤组独活寄生汤低剂量组独活寄生汤中剂量组独活寄生汤高剂量组n 5 5 5 5 5 5 B a x 4 5.2 9±0.4 6 2 9.6 2±0.5 8②3 7.3 9±0.9 1③3 2.0 6±0.4 2 3 8.2 3±0.9 5③4 2.9 4±1.1 1③⑤B c l-2 5 1.9 1±0.6 3 7 1.9 1±1.7 3①5 6.6 3±0.5 3③6 6.0 9±0.8 2 5 4.7 6±0.5 5⑤5 1.7 2±0.5 8④⑤c a s p a s e 3 4 9.8 1±0.6 7 3 1.6 5±0.7 8②3 9.4 2±0.7 3③3 1.6 6±0.5 6 3 8.7 5±0.5 8③4 7.7 2±0.4 7③⑤

本研究首先选用CCK8法观察独活寄生汤含药血清对FLS的增殖影响。CCK8法的基本原理是试剂中的WST-8可被活细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒物质，颜色的深浅与活细胞的数量呈正比。本研究发现，模型组FLS的增殖抑制率明显升高，而与模型组比较，独活寄生汤含药血清干预下的FLS增殖抑制率明显降低，说明独活寄生汤能够有效抑制滑膜成纤维细胞的过度增殖，且呈剂量依赖性。

滑膜成纤维细胞的异常凋亡减少是导致关节炎滑膜增厚的另一原因。细胞凋亡是一个复杂的、受多基因调控的主动程序化死亡过程，在该过程中Bcl-2家族发挥重要作用。Bcl-2家族分为两大类，一是抗凋亡基因，如Bcl-2、Bcl-XL等；另一类是促凋亡基因，如Bax、Bad、Bak等。Bcl-2与Bax形成二聚体，导致Bcl-2的抗凋亡作用受到抑制，因此两者表达水平的相对比值是判断细胞凋亡或存活的重要指标，Bax比例增高，促进细胞凋亡，Bcl-2比例增高，则抑制细胞凋亡[8～10]。caspase3是位于Bcl-2与Bax下游的凋亡执行者，直接导致细胞凋亡。研究发现，RA滑膜细胞过度表达 Bcl-2、p53、p21及c-myc，而正常人滑膜细胞中这些蛋白均不表达，说明RA患者滑膜增殖可能是由于FLS中过度表达Bcl-2等抗凋亡基因导致凋亡不足所致[10]。本研究通过检测FLS中Bax、Bcl-2、caspase3 mRNA和蛋白表达，探讨独活寄生汤是否通过促进FLS凋亡来发挥治疗作用。研究发现，模型组的Bcl-2表达升高，Bax表达降低，提示关节炎模型确实是通过调节Bcl-2和Bax的表达来实现FLS增殖的。独活寄生汤中、高剂量干预后促进Bax的表达，抑制Bcl-2的表达，进而达到促进凋亡的作用。本研究已初步揭示独活寄生汤治疗类风湿关节炎的部分作用机制，但其具体的信号通路尚未清楚，后续研究还需进一步研究其具体机制。

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