三种栽培棉籽油脂组成及相关基因表达分析

薛金爱，高慧玲，高宇，郝青婷，刘宝玲，李润植

(山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801)

中国是世界上棉花单产量最高的国家。但是，由于棉花产量大，生产成本低，相关棉织产品价格低廉，棉花经济效益不高。如何稳定高效的提高棉花的经济效益，已成为目前我国棉花产业发展的关键。棉籽是棉花作物的种籽，是植物油脂的重要来源，因此提高棉籽油利用率对于稳定发展棉花产业起着重要的作用[1]。

目前已有许多学者对棉籽油脂肪酸生物功能进行了研究，一些脂肪酸，特别是不饱和脂肪酸如油酸和亚油酸成为了高值物质。关于脂肪酸生物合成的代谢途径及其调控也受到广泛的关注[2]。棉籽油脂肪酸合成途径受到多种酶的调控，其中β-酮脂酰-ACP合成酶II (KASII)催化16碳酸延长至18碳酸；Δ9硬脂酰-ACP脱氢酶(SAD)催化硬脂酸(18∶0)转化为油酸(18∶1)；Δ12脂肪酸脱氢酶(FAD2)催化油酸 (18∶1) 转化为亚油酸 (18∶2)；二酰甘油酰基转移酶 (DGAT2) 是催化三酰甘油(TAG)生物合成的最后一步。这些相关酶对棉籽油脂肪酸的组成和含量起了决定性作用。因此，明确棉花油脂代谢过程的一些相关酶基因的表达水平，对利用油脂代谢工程定向改造棉籽油成分、含量、棉花育种及棉花综合利用提供一定的理论依据。

棉籽油脂中相对含量较多的3种脂肪酸是棕榈酸(16∶0)、油酸(18∶1)和亚油酸(18∶2)，油酸和亚油酸这两种不饱和脂肪酸的含量接近80%，其中亚油酸(18∶2)含量最高，可高达50%以上[3～5]。棉籽油由于富含不饱和脂肪酸，尤其是亚油酸属于高值脂肪酸，可用于生产特殊用途的食用油，比如高亚油酸保健油等[6]。因此明确棉籽油脂肪酸的组成和含量对于提高棉花的营养价值以及培育专用型油脂品种的选育提供一定的理论依据。虽然目前已有关于棉花脂肪酸组成的报道[7～9]，但是关于对3种栽培棉进行比较分析的报道很少。为此，本文以3种栽培棉海岛棉(G.barbadense)、亚洲棉(G.arboretumL.)和3种陆地棉(G.hirsutum)为试验材料，提取棉籽油进行粗脂肪定量，使用气相色谱分析(GC)对棉籽油中的脂肪酸组成和含量进行分析，并利用qRT-PCR技术分析4个相关酶基因的表达水平，以期解析3种栽培棉籽油脂肪酸组成差异的分子遗传基础，旨在为培育棉籽油专用型品种以及提高棉花综合利用价值提供理论依据和指导。

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂

材料：海岛棉pima379、亚洲棉石系亚1号和陆地棉(徐19、冀丰1271、中棉所2)，种植于山西农业大学农学院实验基地。

主要试剂:氯仿∶甲醇(2∶1)、0.9% KCL、甲醇钠、异辛烷、RNA提取试剂盒等。

1.2 主要仪器与设备

气相色谱仪(美国安捷伦7890B)、摇床、离心机、氮吹仪、PCR仪等。

1.3 试验方法

1.3.1 棉花种子的收集

选用种植于山西农业大学农学院实验基地的棉花材料，在授粉棉铃25 d后，取胚珠液氮速冻后保存于-80 ℃，用于表达试验；并收获其种子用于油脂提取。每种材料选用3粒饱满的种子，以备重复实验。

1.3.2 棉籽油脂的提取以及含油量的测定

分别称取50 mg充分研磨的去壳干种子粉末于离心管中，加入甲醇∶氯仿(2∶1)溶液，摇床抽提24 h，离心后收集上层有机相，加入氯仿、NaCl溶液，离心10 min，收集下层有机相到称重的玻璃管中，氮气吹干后称出玻璃管及脂肪酸的总重量。计算方法：

总脂含量=(提取后总重-提取前管重)/0.05。

1.3.3 棉籽油脂的甲酯化

将提取的棉籽油甲酯化，先加入甲醇钠，混匀后震动20～45 min。然后加入异辛烷，混匀、离心、静置使溶液分层。最后加入0.9% KCL, 混匀，离心至溶液分层，用玻璃吸管吸取上层(含脂肪酸甲酯FAME)溶液，放入GC小瓶中编号，放入-20 ℃冰箱保存待测。

1.3.4 棉籽油脂肪酸成分的测定

将甲酯化后的样品用气相色谱仪进行分析测定，参数条件为：进样口温度为260 ℃，高纯氮气作为载气；检测器温度250 ℃；色谱柱型号：HP-88(100 m*0.25 mm*0.2 μm)。利用17种混标中各脂肪酸甲酯(FAME)保留时间的对比确定样品中FAME的种类，利用峰面积归一化法确定各FAME相对含量，计算方法为：某一种FAME相对含量=(某一FAME的峰面积/总FAME的峰面积)×100%。

1.3.5 相关酶基因的表达分析

1.3.5.1 序列查找及保守区同源引物的设计

在Cottongen数据库(https://www.cottongen.org/)中blast搜索找到海岛棉、亚洲棉和陆地棉的FAD2、KASII、DGAT2、SAD对应的CDS序列，然后在开放阅读框内经比对分析，找到对应的保守区，利用Primer primer5.0软件设计引物用于qPCR反应(表1)。

表1 试验所用引物Table 1 The primers of present experiment

1.3.5.2 棉花胚珠总RNA的提取和cDNA的合成

采用北京康润(Genstar)公司的Plant RNA Kit试剂盒提取棉花25 d胚珠总RNA，具体试验方法参照试剂盒说明书，采用Genstar(康润公司，北京)反转录试剂盒按说明书进行cDNA第一链的合成。

1.3.5.3 qRT-PCR验证基因的表达

以陆地棉GhEF-1α，海岛棉GbUBQ7作为内参，并用qPCRsoft3.0(2-ΔΔCq)对试验结果进行分析，Origin 6.0绘制柱形图。反应体系参考Takara公司试剂盒说明书推荐的20 μL体系，PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变形30 s，58 ℃退火15 s，40个循环，试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 5种棉籽油的含油量的分析

经分析，5种棉籽油材料的含油量均可达到30%以上，最高的为陆地棉冀丰1271，可达40.18%，最低的为海岛棉pima379，含量为35.66%。(表2)。

表2 5种栽培棉棉籽油含油量Table 2 The Oil contents of five kinds of cotton seeds

2.2 5种棉籽油的FAME 组成以及含量的分析

由气相色谱分析得知(图1)，5种棉籽油脂肪酸甲酯(FAME)主要集中在C16∶0(棕榈酸)、C18∶0(硬脂酸)、C18∶1(油酸)、C18∶2(亚油酸)。经计算分析得到5种栽培棉棉籽FAME的组成和含量(表3)，由表可见，5种材料脂肪酸甲酯总含量不存在显著差异。其中饱和脂肪酸主要集中在C16∶0，含量在21%～25%之间，而不饱和脂肪酸主要是C18∶1、C18∶2，二者总含量可以达到70%以上，尤其是C18∶2的含量最高，与C16∶0、C18∶0、C18∶1的含量存在显著差异。

每种棉籽油的FAME组成在相对含量上也有一定的差异，陆地棉徐19的C16∶0含量最高，陆地棉中植棉2最高值则是C18∶2，而海岛棉pima379在C18∶0达最高值，亚洲棉石系亚1号中含量最高的是C18∶1，可达33.46%，是其它4种材料含量的二倍，由于其C18∶1含量高，所以导致其C18∶2的含量比海岛棉和陆地棉的都低。

2.3 棉籽油代谢途径相关酶基因的表达分析

经qRT-PCR分析(图2)5种棉籽油材料油脂代谢途径4种相关酶基因在棉籽胚珠中都有一定的表达，但各酶基因表达量有一定的差异。

图1 5种棉籽油材料的GC图谱Fig.1 Gas chromatograms of five kinds of cotton seeds

脂肪酸甲酯FAME海岛棉pima379Gb．pima379亚洲棉石系亚1号Ga．shixiya1徐19Xu19冀丰1271Jifeng1271中植棉2号CCRI2平均含量AveragecontentC16∶0238321712447220921162265bC18∶0320248211228214244cC18∶1194333461679155515932023bC18∶2535442615664600860775473a

注：不同字母代表p<0.05差异显著

Note: Different letters represent significant at 0.05 level.

图2 5种棉籽油4个油脂代谢相关酶基因的表达分析Fig.2 The expression and analysis of four oil metabolism related enzyme genes in five cotton seed oil

5种材料中FAD2的表达量均是最高，其余3个酶基因的表达存在一定的差异。中植棉2号SAD的表达量最低，其它4种材料是KASII的表达量最低，表达量仅是FAD2的1/3。海岛棉pima379、中植棉2号、冀丰1271和徐19中DGAT2的表达量仅次于FAD2的表达量，而亚洲棉石系亚1号中SAD的表达量次于FAD2，DGAT2的表达量低于FAD2和SAD。

3 结论与讨论

棉籽油脂既是食用油的主要来源,又是重要的工业原料，因而具有重要的经济价值[10]。棉籽油脂肪酸成分包括饱和脂肪酸类和不饱和脂肪酸类；饱和脂肪酸类包括棕榈酸和硬脂酸；不饱和脂肪酸类包含油酸和亚油酸。棉籽脂肪酸以不饱和脂肪酸为主，2种主要不饱和脂肪酸占棉籽总脂肪酸含量的70%以上，亚油酸是占比最大的脂肪酸[11]。本文对棉籽脂肪酸成分分析结果显示，3种栽培棉中陆地棉材料的含油量相对高于其它2种，这与前人研究结果一致。目前，我国陆地棉栽培面积比例可达90%以上[12,13]。而棉籽油脂的经济价值及用途的决定因素是其脂肪酸组成和含量。大多数研究人员对亚油酸的关注更高。本文通过对棉籽油脂肪酸成分分析发现了另一个值得关注的脂肪酸——棕榈酸，棉籽油饱和脂肪酸棕榈酸(16∶0)的含量可高达20%以上，远高于另一种饱和脂肪酸硬脂酸(18∶0)，而且也高于大豆等其它油料作物。如将其部分甚至全部转化为棕榈油酸(16∶1)，将为生产生物柴油提供最佳的生产原料，这样不仅可以充分提高棉籽油的工业价值，同时也为培育专用型

棉花品种指明了方向，为稳定而高效发展棉花产业做出贡献。

本文在前人对脂肪酸代谢途径相关研究的基础上[2],进一步对棉籽油脂肪酸代谢相关酶基因进行组织表达分析,可以进一步阐明棉籽油脂肪酸代谢的分子遗传基础，而且对利用代谢工程组装技术改善棉花种子中脂肪酸的组分和品质具有重要的指导意义。棉籽油脂肪酸组成和含量取决于脂肪酸代谢途径的一些相关酶的表达情况。FAD2催化油酸(18∶1)转化为亚油酸(18∶2)，本文获得结果表明5种材料均是FAD2的表达量相对高一些，这是对棉籽油富含不饱和脂肪酸尤其是亚油酸(18∶2)的一个很好的诠释。3种陆地棉材料均是DGAT2的表达量较低于FAD2的表达量，海岛棉和亚洲棉材料DGAT2的表达量相对低一些。这与海岛棉和亚洲棉这2种材料含油量相对比较低是符合的。亚洲棉则是SAD的表达量较低于FAD2的表达量，SAD催化硬脂酸(18∶0)转化为油酸(18∶1)，亚洲棉籽中油酸(18∶1)的含量最高，最接近亚油酸(18∶2)的含量。5种材料中除了陆地棉中植棉2，其余的KASII的表达量均是处于最低水平，KASII催化16碳酸延长至18碳酸，因此硬脂酸(18∶0)的含量也属于最低。本研究对棉籽油脂肪酸组成的分子遗传基础进行了验证，结果可为棉籽油的营养价值、工业价值的深度利用以及提高棉花综合利用价值提供理论依据及参考信息。

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