鸭坦布苏病毒病灭活疫苗生产工艺的研究

何平有 ，刘 涛 ，杨保收 ，林 建 ，邹立宏 ，邱贞娜 ，郁宏伟 、2，赵玉龙 ，刘 浩

（1.瑞普（保定）生物药业有限公司，071000；2.天津瑞普生物技术股份有限公司，300308；3.北京市农林科学院畜牧兽医研究所，100097）

鸭坦布苏病毒病(DTMUV)是鸭坦布苏病毒病的病原，引起不同日龄的北京鸭、樱桃谷鸭、金定鸭和麻鸭等发病，主要表现为精神沉郁、产蛋下降和死淘率增加，给养鸭业造成了严重经济损失。在DTMUV的疫苗研究中，近年来有利用禽胚及其成纤维细胞、传代细胞等培养病毒的报道[1]，但受病毒株系差别、培养体系等因素影响，其增殖条件和疫苗效果差异比较大。笔者为提高DTMUV HB株疫苗的生产效率和产品品质，对HB株细胞适应毒在鸭胚成纤维细胞上的增殖条件进行筛选，拟确定该疫苗的最佳生产工艺。

1　材料

1.1　毒种

鸭坦布苏病毒HB株F4代细胞适应毒由瑞普公司质量管理部提供。

1.2　细胞

购自河北省未感染坦布苏病毒健康鸭群所产种蛋，自行孵化至适宜日龄备用，制成成纤维单层细胞。

1.3　培养基

DMEM培养基和新生牛血清均购自Gibco公司。

2　方法

2.1　最佳接毒比例的确定

分别按0.25%、0.5%、1.0%和2.0%的比例将毒种接入致密鸭胚成纤维单层细胞，每个比例接种3瓶，补加含2%新生牛血清的DMEM液，置37℃含5%CO2的培养箱中培养，逐日观察细胞病变（CPE），当CPE达到75%～80%时收获病毒悬液。将收获的病毒液分别取3个适宜的稀释度按中国兽药典方法测定其病毒含量[2]。

2.2　最佳收获时间的确定

按2.1优选的接毒比例分别接种鸭胚成纤维单层数瓶，于接毒后72、78、84、90和96h，每个时间点分别随机取出2瓶，重复3次。按2.1的方法测定病毒含量。

3　结果与讨论

3.1　最佳接毒比例的确定

结果详见表1。由表1可见，4个接毒比例以0.5%接毒比例收获的病毒液病毒含量最高，均不低于106.7TCID50/0.1m l，1%接毒比例次之，0.25%和2%接比例量最差。因此，最佳接毒比例为0.5%。

3.2　最佳收获时间的确定

结果详见表2。由表2可见，随着收获时间的延长，收获病毒液的病毒含量呈一个先上升后下降的趋势；其中接毒后84小时病毒含量最高，三批次毒液病毒含量均不低于107.1TCID50/0.1m l；其次是接毒后78h收获的病毒液，三批次病毒含量在106.5～106.9TCID50/0.1m l。

4　讨论

本研究成功实现鸭坦布苏病毒培养从组织培养向细胞培养的转变，在实验室前期细胞适应株DTMUV HB株的基础上，对不同接毒比例和收获时间进行优化，为进一步完善该疫苗株的生产工艺提供技术支持。

从不同接毒比例看，当接毒比例从0.25%提升至0.5%时收获病毒液的病毒含量，从105.9～106.1TCID50/0.1ml提升到106.7TCID50/0.1ml以上，而后随着接毒比例上升，出现病毒含量下降。因此，接毒比例并不是简单的越高越好，它们之间存在一个最适合的比例，本研究的最佳接毒比例为0.5%。

从不同收获时间看，当收获时间从接毒后72小时至84小时，收获毒液的病毒含量从106.1～106.3TCID50/0.1ml提升到107.1TCID50/0.1ml以上，而后随着收获时间延长，出现病毒含量下降的情况。这可能与鸭坦布苏病毒的特性相关，收获时间早病毒增殖尚未达到繁殖高峰；随着时间延长而增加，收获高于84小时，病毒繁殖达高峰后大量病毒暴露在高温环境中失活而导致病毒含量下降。

表1　不同接毒比例制备病毒液病毒含量测定结果单位：TCID50/0.1m l

表2　不同时间收获病毒液病毒含量测定结果单位：TCID50/0.1m l

[1]张玥.鸭坦布苏病毒的分离、致病性和细胞适应性研究[D].哈尔滨：东北农业大学，2013.

[2]中国兽药典委员会.中华人民共和国药典（2015年版,三部）[M].北京∶中国医药科技出版社,2016.