甘肃省正常新生儿干血斑氨基酸及酰基肉碱串联质谱检测指标医学参考范围的调查

刘芙蓉，王　兴，孙小红，郑　雷，周秉博，郝胜菊

(甘肃省妇幼保健院医学遗传学中心，甘肃省出生缺陷防控重点实验室，兰州　730050)

1　材料和方法

1.1研究对象选取2015年1月～2016年12月，自甘肃省各地州市送往本中心进行串联质谱法遗传代谢病检测的足跟血滤纸血片进行检测。选取标准：按照《新生儿疾病筛查技术规范》[4]的要求，剔除未渗透、发霉及采血时间不足等标本，由本院新生儿疾病筛查中心人员对血片质量严格审核，将77 957例合格标本进行检测。

1.2仪器与试剂美国Waters串联质谱仪、PerkinElmer恒温孵育振荡器、超声清洗仪、全自动打孔器Wallac DBS Puncher 9，试剂是PerkinElmer公司生产的NeoBaseTMNon-derivatized MSMS Kit。

1.3方法

1.3.1样本采集和发送：采集新生儿足跟血，要求充分哺乳72 h后，滴注于专用滤纸片上，使血斑自然渗透，室温下自然晾干。要求血斑直径>8 mm，每份标本至少2～3个血斑。2℃～6℃存放于干燥低温环境中，一周内将标本寄送至本院新生儿疾病筛查中心，初审合格标本送至本中心进行检测。

1.3.2方法：按NeoBaseTMNon-derivatized MSMS Kit说明书中规定进行实验操作。利用全自动打孔器选取血斑半径3/4处进行打孔。每一个反应板均带有试剂盒中提供的室内质控样本，以保证实验的正确性及稳定性。将直径3.2 mm的待测样品血斑和质控品置于96孔V型底萃取板中，每孔中加入现配的100 μl内标工作液 ，其中V(氨基酸/酰基肉碱内标原液)∶V(萃取工作液)=1∶110；反应液封板，置于45℃700 r/min的恒温孵育振荡器中震荡45 min；转移75 μl萃取液于V型截底96孔板内，以铝箔封套密封微孔板；利用串联质谱仪检测各萃取标本中酰基肉碱的浓度。

1.4统计学分析应用SPSS19.0软件将整理后的检测结果进行统计分析，采用单样本Kolmogorov-Smirnov 检验判断资料的正态性，检验结果P>0.05时符合正态分布资料，正态分布资料95%，99%的参考范围，分别取“1.96s±1.96s”，“2.58s±2.58s”值；非正态分布资料应用百分位数法，95%，99%的参考范围分别取“P2.5～P97.5”，“P0.5～P99.5”值。

2　结果

2.1正态分布检验本研究应用单样本Kolmogorov-Smirnov检验对串联质谱检测结果中11种氨基酸和31种酰基肉碱进行正态性检验，结果显示均呈非正态分布。

2.2甘肃省新生儿干血斑样本中11种氨基酸、31种酰基肉碱正常医学参考范围的确立医学上通常将生化指标中95%人群所在范围作为该指标的正常参考范围[2]。本研究通过检测甘肃省77 957例新生儿足跟血标本，将结果进行统计分析，以百分位数(P2.5，P97.5)表示，统计出甘肃省新生儿遗传代谢病筛查串联质谱指标中11种氨基酸(见表1)和31种酰基肉碱(见表2)代谢物的正常参考范围。

表1

串联质谱检测的11种氨基酸指标参考范围(μmoL/L)

表2

串联质谱检测的31种酰基肉碱指标参考范围(μmoL/L)

3讨论串联质谱技术是近年来迅猛发展的一种灵敏、快速、高通量和选择性强的技术，具有高特异度、高敏感度等特点，可同时筛查数十种至上百种遗传代谢病[5]。近年来先后多项研究报道了使用串联质谱技术检出在不同国家、地区、民族中存在不同的差异[6，7]，我国上海地区首先应用串联质谱技术进行遗传代谢病筛查，目前已有200多家机构在新生儿遗传代谢病筛查中开展串联质谱筛查技术，年筛查量达200万人次以上[8～10]。筛查疾病种类拓展至40多种遗传代谢病[11]。因此，以串联质谱技术为基础的筛查治疗系统，提高了新生儿筛查的质量，填补了我国多种遗传代谢病筛查治疗的空白，为提高我国出生缺陷工作做出重要贡献。

甘肃省遗传代谢病发病率高于全国平均水平，其中苯丙酮尿症(PKU)发病率约为1/3 000[12，13]，远高于南方及沿海城市[14，15]。由于我省地处西北内陆区，经济、医疗发展水平相对落后，直到2015年才引入串联质谱技术，目前已逐步推广该技术应用于本省新生儿遗传代谢病筛查，而建立适合本地新生儿群体的串联质谱筛查指标医学参考范围是进行检验结果判断的基础。本研究统计分析我省77 957例新生儿足跟血标本，结果显示串联质谱检测的42项指标均为非正态性分布，这与本中心之前报道[16]的结果存在偏差，可能与样本量和正态性分布检验方法不同有关。而新生儿用药、营养补液、标本采集与保存等因素会造成部分结果异常增高[17，18]。另外，本次调查补充了该省正常新生儿干血斑酰基肉碱串联质谱检测指标，由于样本量扩大，本次研究的结果更为准确。

通过对近8万例新生儿串联质谱筛查数据统计分析，建立本地新生儿群体该法检测指标的医学参考范围，能更好地辅助临床对检验结果的解读。

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