肿瘤标本库建设研究进展

马纪，王剑松，颜汝平，王海峰

（昆明医科大学第二附属医院泌尿外科一病区，云南　昆明　650101）

从上个世纪后半期以来，在全球范围内恶性肿瘤的发病率与死亡率均呈显著上升趋势，尤其在60、70年代后，癌症发病数以年均3%～5%的速度增长，成为了人类死亡的主要原因之一。根据WHO提供的数据，大约每年有1 000万被新诊断为恶性肿瘤患者，并且其中绝大部分出现在发展中国家。我国自改革开放以来，社会、经济、环境以及生活方式发生了很大的改变，老龄化程度越发严重。目前，我国已成为恶性肿瘤新发病例最多的国家之一，这必将对经济、社会以及家庭产生重要影响。肿瘤防治已成为重要的公共健康问题。因此恶性肿瘤的研究也已成为医学研究的热点。通过近年来的不断努力，研究方法以及相关研究设备的改进，对恶性肿瘤研究已经取得了一定的进展。但是恶性肿瘤的研究面临着肿瘤标本等研究资料的相对匮乏，可重复性弱，研究进程较慢等。研究人员可以通过肿瘤组织、血液、尿液等相关标本，进行相关的实验室研究，譬如肿瘤发病机制、特异性抗原筛选，靶向药物研发等，从而获得大量的信息。然而各大医疗机构在临床工作中产生的大量肿瘤标本由于缺乏系统地收集管理，对实验室研究而言珍贵的研究素材—肿瘤标本白白浪费。如何将珍贵而有限的人类恶性肿瘤资源收集并将其充分利用于肿瘤的研究，人们找到了科学合理的解决方法。

从二十世纪末期开始，欧美等发达国家兴起了标准化肿瘤标本库的创建，例如奥地利基因组织库建立于1983年，目前已储存百万例病变或者正常的组织，美国MD癌症中心较早建立了头颈外科肿瘤标本库和胰腺肿瘤组织库[1]，储存相关恶性肿瘤标本、癌旁组织、正常组织达万例；2000年，华盛顿大学医学中心等研究机构成立了前列腺癌合作单位，收集了数千例前列腺癌标本[2]。国内最早开始进行肿瘤标本库建设的机构是北京大学临床肿瘤学院，于1996年建库，收集了常见普外科肿瘤组织、肿瘤患者血清标本等[3]。目前国内外各大高校与科研机构，先后建立起了多病种的肿瘤组织库或侧重于某一研究领域专门的标本库，并予以配套了相关的采集、保存、日常管理以及临床流行病学等资料收集的规范[4-6]。对于相关标本库的创建、管理、维护、使用等相关问题。我们做了一些相应的资料进行收集、研究和分析，现综述如下。

1　收集前注意事项

根据医学伦理学要求的人体组织相关的科学研究的规范，应当对患者及家属告知情况，征得同意：需在术中切取标本，并签署术中留取标本协议书。术前与病理科协商，在保证病理检查前提下，收集少量组织入标本库储存，标本体积较小或难以分辨时应当立即放弃。无论是收集或是使用标本，都应当获取伦理委员会批准[3]。

2　场地、设备、信息管理系统及相关规程

肿瘤组织标本库的建立和管理需要医院相关管理部门、临床科室、病理科及实验室的协助和参与，应当有科学合理的建库条件，且合理布局。在医院手术室设立标本采样间，包括组织取材的工具如，手术刀、精细剪、镊子、无菌手套等，为保证取材流程无菌状态，取材工具应当常规消毒，并进行相应包装保存。血液标本采集装备：离心管、吸管、采血管、保存盒等。临时运输保存设备：如小容量液氮罐；在实验室设有专业的库房，应当合理布局：大型液氮罐、-80℃超低温冰箱，并连接温度监控报警系统。制定相应的应急预案，需专门的管理人员负责库房管理，如遇停电等能及时将标本转移出超低温冰箱至液氮罐；对火灾及其他突发情况也应有相应应急预案。对标本后期研究及质量控制管理，还需要专业设备仪器，如：紫外分光光度计、电泳仪、高速离心机、基因扩增仪及其灭菌设备等[3]。相应管理工作还需配备相应的电脑、打印机、相机等。日常管理：工作人员出入采样间或库房须佩戴一次性口罩帽子，穿隔离衣，采集标本时应当遵守手术室无菌操作原则，所有器械和冻存管使用前应当消毒，避免对标本组织产生干扰。标本的储存应当分为多份，避免反复冻融，影响标本质量。信息管理系统：标本库的管理系统与医院临床、病理、影像科室及实验室系统进行一定程度信息共享，并且制定相关的临床科室、伦理委员会的申请查询、审批制度。制定标准操作规程：医院临床工作流程中增加相应的与标本库建设相关的流程：如相应手术术后常规按规程采集标本，入库、登记等。

3　标本的采集与保存

制定严格的操作规范：手术室内配备专人进行肿瘤标本采集，并且制定相关的操作规范，技术要求。

3.1肿瘤标本组织的收集[7]首先肿瘤的离体与收集应当在相应的无菌环境中进行，术中由外科医生切除肿瘤组织及相关器官后，采集者应当确定肿瘤组织、肿瘤旁组织和切缘远端非肿瘤组织的区分。比如取材时应注意肿瘤组织的数目、大小、形态、颜色、硬度，明确区分肿瘤组织与非肿瘤组织，保证取材质量；并且保证标本采集后的残存组织能够不影响术后病理诊断，避免不必要的医疗纠纷，肿瘤组织体积明显较小则不宜取。若肿瘤标本符合取材条件，则应适当分离肿瘤与肿瘤旁组织，并测量其大小，照片存档[8]；使用专门手术器械（应严格消毒）分别切取肿瘤组织、肿瘤旁组织（距离肿瘤组织2 cm的组织）和切缘远端非肿瘤组织（距离肿瘤组织＞5 cm的组织）各数份。切取的肿瘤组织块大小一般为：0.3～0.5 ml，切取数块，有利于减少冻溶循环频率且冷冻速度快[9]。快速分类后，装入冻存管内，标本的保存首先根据科研机构及医院各个课题组的要求条件保存，例如：冰冻标本则直接转入液氮罐或-80℃冰箱内。石蜡标本[10]则予以10%福尔马林固定后，进行石蜡包埋。肿瘤组织在离体后一段时间内会有因缺血原因造成的mRNA降解，对其蛋白质的表达和磷酸化水平会有一定程度的影响[11]。目前普遍认可的观点是采集并转运过程时间应当保证在肿瘤标本或者该器官组织切除离体后15 min内（最长不应当超过半小时）[12]，也有学者建议离体2 h内的标本也可收集。日常实践时，由于手术相关情况，组织血供已断，缺血时未能及时取出标本，或术后需将完整标本照相或给家属看等，未能在规定时间取出标本，因此也会造成部分标本质量下降。为了增加肿瘤标本收集效率，标本切除后2 h以内的标本通常也有收集。收集后应记录标本相关信息，如：标本离体时间，存入冻存管编号，标本种类，器官或组织类型，液氮罐或超低温冰箱内摆放位置。

3.2其他标本的收集

（1）尿液：取得病人及其家属的同意后，用开口较大容器收集（容量一般大于20 ml）。建议采集中段尿，并且应当避免阴道分泌物、月经等污染，加入甲醛或甲苯等防腐剂后，冷藏于4℃冰箱内。具体采集有：①随机尿：较适合细胞性研究；②晨尿：比较适合检测尿液中白细胞、红细胞等浓缩物质。

（2）血液标本：对于入院治疗患者（手术、化疗、放疗）可以将抽血时间分为数次：入院后第1天抽血、治疗后当天、术后不同时段等。采集数量一般为5～10 ml，血样分成两份标本：一份不抗凝，离心后，吸取上层血清，按照一定规格分装，最后置入-80℃冰箱或液氮罐中（多作蛋白质相关研究）；另一份加入抗凝剂及淋巴细胞分离液，后离心分离有核细胞，抽取后置无菌Ep管中（可做DNA、RNA提取及其它相关研究），向其中加入RNAlater保存液，分装后同样置入-80℃冰箱或液氮罐。存入的标本行相关信息采集，做好登记，避免抽取血液标本后等待时间过长，细胞mRNA、蛋白质降解，应当在采血后快速保存。

4　标本的质控与抽查

标本采集、运输、使用过程中可能由于操作不当或者因为标本本身成分混杂，坏死、炎性组织太多，需要的肿瘤组织过少或者保存中设备异常或使用不当，导致标本质量下降。质量控制是指在肿瘤标本库日常运行过程中，在采集，转运，保存、信息记录、仪器设备检查维护等相关流程里，规范操作，且控制组织样本质量，剔除其中不合格样品，为了使其能够较好地应用于实验室研究。对于肿瘤组织、血液等标本要避其DNA、RNA和蛋白的降解，保证其质量合格，因此应当在日常管理流程中制定有利于标本检测的制度，首先是建立标本使用者的信息反馈制度，根据其使用情况，对标本的质量有一定程度的了解，其次在收集标本组织（肿瘤、癌旁组织）时应当同时收集多份，在其中存留1～2份已被后期质量控制分析使用。研究表明DNA不易降解，质控的难点在于RNA的保存，对肿瘤标本库内标本进行定期随机抽样调查，主要是针对RNA，具体操作简述为[12-13]：对抽样标本的备用份行总RNA进行提取，并对其予以紫外分光光度计分析，分析结果若A260/A280＞1.6，后行1%琼脂糖凝胶电泳，如若可见28 s和18 s条带，且前者的亮度能够达到是后者的1～2倍，则表明肿瘤组织RNA未被降解，其质量合格并可以运用于实验研究。研究发现肿瘤标本采集时间对样本RNA质量和完整性存在着较大影响，肿瘤组织离体时间越短，采集后组织RNA的降解越少，其保存完整性越高。

5　　构建病例随访平台

与患者沟通，取得其同意后，将其纳入随访平台中，对应每一个采集的标本的患者，针对其病情制定与之相匹配的随访方案，目的在于可以为一些前瞻性临床研究留下相关资料，便于观察患者疾病的发生、进展等。可以对患者动态管理，且临床资料能够动态收集。对于该平台数据录入方面，应当包括患者的一般信息（姓名、年龄、性别、联系方式、家庭住址、住院时间、住院号等）、临床资料（包括临床诊断、病理、影像资料、相关病例、病程资料等）、随访记录、术后恢复情况、并发疾病情况、术后复发及疾病进展情况、死亡原因和死亡日期等。

6　标本信息库运作流程

恶性肿瘤标本库的建立比较重要的一个环节是建立一个与之匹配信息管理系统，可以满足标本库日常运作所需的信息录入、储存、查询等功能，若条件允许，则应与医院及实验室相关数据库相关联，能够进行临床病理、影像学资料、实验室相关数据的链接。具体操作如下：首先是患者一般信息及临床资料的录入[14]：姓名、性别、年龄、出生地、住院号、临床诊断等；肿瘤标本信息录入：包括入库编号、收集时间、入库时间、标本类型、取材器官、冻存方法等；标本存放信息：相应的液氮罐或-80℃超低温冰箱编号、存放架编号、存放坐标、冻存管规格型号、标本数量等；标本使用管理[15]：出库时间、使用相关课题或用途、使用者、使用数量、出库办理人员等；标本废除信息：入库编号、存放架编号、废除日期及其废除原因；信息查询功能：包括数据导入、导出、查询、统计等；出库登记：管理人员严格按照标本库制定的标本入、出库程序进行标准化管理，标本使用需申请，经医院主管人员和肿瘤库负责人审批后行标本出库登记。

7　标本库相关伦理法律问题

患者是肿瘤组织的所有者，标本库的建立设计了活体组织的收集、保存和使用涉及到伦理学及法律的部分问题，《侵权责任法》规定，应当保证患者的知情权和自主权，因此在收集标本前应签署相关文书，并且保证患者在收集、保存、使用、信息采集的过程中有撤销同意的权利。使用时应当进行相应单位的审批程序，并且在此过程中保护患者隐私，维护其利益。也有一些研究机构认为患者捐献标本有一定商业价值，应当予以。而且对标本使用严格把关，相关研究应当是正当的科学研究，有利于大众，符合伦理学要求。

8　结语及展望

随着人口老龄化的不断发展，肿瘤的高发，其研究成为医学的热点和重点。虽然近几十年来，随着研究相关设备的不断改进，研究方法的不断创新，肿瘤相关研究已经有了较快发展和比较丰硕的成果。此时作为恶性肿瘤研究材料的肿瘤组织标本在促进肿瘤研究进展过程中就扮演了重要的角色，成为了肿瘤研究工作的重要支撑。肿瘤组织标本库的建立为研究提供高质量标本，一定程度上解决研究的重复性较差，研究周期长，进程较慢的问题；目前肿瘤标本库的建立及管理尚处于起步阶段，还有许多不足之处：①与国外大型肿瘤标本库相比，国内的明显规模较小，且缺乏统一管理和信息互通；②对于建立儿童肿瘤标本库的报道甚少，标本库数据源独立，尚未提供与医院病案信息系统、实验室检查、影像学检查信息系统等的数据接口；③信息化滞后，无法形成各大医院、科研机构之间大数据共享，有赖于医院信息管理水平的提高，加大对肿瘤标本库的重视度，以及各单位、地区之间的进一步协作。

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