壳聚糖及其衍生物的抗氧化应激和抗炎症作用机制

郑亚光 闫素梅 史彬林 张博綦 赵艳丽

(内蒙古农业大学动物科学学院，呼和浩特 010018)

壳聚糖又称脱乙酰甲壳素，是由自然界广泛存在的几丁质经过脱乙酰作用得到的。甲壳素又称甲壳质、几丁质，是1811年由法国化学家Henri Braconnot首先从蘑菇中分离的，是最早知道的多糖，已经被发现是世界上第二大丰富的天然生物聚合物，其中海洋生物储量达到106～107t[1]。甲壳素可被强酸分解成乙酸和壳聚糖，也可以通过纤维素酶、脂肪酶、蛋白酶和壳聚糖酶等非特异性酶作用，进一步生成壳聚糖和氨基葡萄糖2个主要衍生物[2]。壳聚糖或几丁质通过酸水解和酶降解方法可得到几丁质寡糖(chitin oligosaccharide，NACOS)和壳聚糖寡糖(chitosan oligosaccharide，COS)。大量研究表明，壳聚糖是一类具有抗细菌、抗真菌、抗糖尿病、抗癌和降胆固醇特性的生物活性阳离子多糖，同时具有抗氧化与抗炎症作用，对饲料中绿色饲料添加剂的开发应用具有重要的意义；壳聚糖的衍生物NACOS和COS的水解产物易溶于水，在中性pH下具有低黏度和较高溶解度，由于氢键的作用减弱，显示出更好的抗氧化活性，使得其在生产和研究中的应用更加广泛[3-4]。本文综述了壳聚糖及其衍生物抗氧化、抗炎症等作用的相关机制，为其深入研究及开发利用提供理论依据。

1 壳聚糖及其衍生物的抗氧化与抗炎症作用

壳聚糖及其衍生物具有重要的生物抗氧化作用，在体内研究中，壳聚糖通过降低全身循环中的氧化应激指标水平，表现出直接的抗氧化活性。大鼠饲粮中补充壳聚糖可减弱心肌中由于异丙肾上腺素诱导的氧化应激，并增强幼龄和老年大鼠的谷胱甘肽(GSH)依赖型抗氧化系统，从而提高抗衰老作用[5]。在小鼠巨噬细胞的研究中证实，NACOS对骨髓细胞中的髓过氧化物酶(MPO)活性具有抑制作用[6]。NACOS提高细胞内过氧化氢酶(CAT)活性和GSH含量，表明NACOS在活细胞中可以作为有效的抗氧化剂[7]。研究表明，COS可抑制鼠黑素瘤细胞系中细胞内自由基的产生，诱导细胞内GSH含量增加，对基因组DNA的氧化损伤具有保护作用[8]。COS对过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)的氧化损伤具有保护作用，活性氧(reactive oxygen species，ROS)可氧化生物分子，如脂质、蛋白质、碳水化合物和DNA等，是引起细胞氧化应激的主要自由基之一[9]，除了细胞内ROS水平的显著降低外，COS还对脂质过氧化产物如丙二醛的产生具有抑制作用，恢复内源性抗氧化剂(包括超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶)的活性，提高一氧化氮(NO)承载力和诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)活性，说明COS可以有效地保护HUVEC免受过氧化氢的氧化应激，提示COS在预防和治疗心血管疾病中将发挥重要的作用[10]。COS能够保护人胚胎肝细胞免受过氧化氢诱导的氧化应激，表明COS对临床肝损伤期间可能存在的氧化应激具有减缓作用[11]。

研究表明，在干乳期奶牛基础饲粮中添加壳聚糖，可显著提高血清中免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白A(IgA)的含量，提示壳聚糖可以作为奶牛的免疫增强剂[12]。另有研究发现，壳聚糖可以显著提高奶牛的4%标准乳产量，提高血液中活性T淋巴细胞、B淋巴细胞含量，显著提高血清中IgM、IgG含量[13]。饲粮中添加一定剂量的壳聚糖可显著提高奶牛的产奶量，降低乳中体细胞数，并可增强奶牛的抗氧化能力，血清超氧化物歧化酶(SOD)活性与总抗氧化能力(T-AOC)均呈明显的升高趋势[14]；壳聚糖可能通过提高抗氧化能力缓解断奶应激，进而促进了断奶仔猪的免疫功能[15]；对肉牛的试验也发现，饲粮中适宜剂量的壳聚糖可提高肉牛的抗氧化和免疫功能[16]。壳聚糖对肉仔鸡生长和免疫的影响与添加量有关。饲粮添加0.05%壳聚糖时，可明显提高肉仔鸡的生长性能；而添加更高水平壳聚糖时，虽免疫功能有所增强，但生长性能却有下降趋势。因此，0.05%可看作壳聚糖的适宜添加量。此外，适宜添加量的壳聚糖可在一定程度上改善肉仔鸡的肠道微生态环境[17]。另有试验研究了蛋鸡饲粮中添加不同水平壳聚糖对蛋品质及蛋黄抗氧化指标的影响，饲粮中适宜添加量的壳聚糖可在一定程度上改善蛋鸡的蛋品质和蛋黄的抗氧化指标，还可以降低脂肪酶活性和粗脂肪表观代谢率，提高蛋白酶活性和其他营养物质的表观代谢率[18]。COS可减轻试验性自身免疫性葡萄膜炎大鼠的眼部炎症，通过减少氧化应激和炎症反应预防视网膜缺血和灌注损伤[19]。饲粮中适宜添加量的壳聚糖能够促进断奶仔猪的生长，降低腹泻，缓解断奶应激[20]。

2 壳聚糖及其衍生物的抗氧化应激与抗炎症作用机制

2.1 通过调节体内免疫调节因子发挥抗炎症作用

肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是一种单核因子，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，巨噬细胞在分泌NO和促炎细胞因子如TNF-α和白细胞介素-6(IL-6)的免疫应答中起重要作用[21]。巨噬细胞被脂多糖(LPS)诱导激活后，可产生和释放大量的iNOS，进而模拟建立不同的炎性疾病模型，包括组织损伤和败血性休克[22]，以研究壳聚糖及其衍生物的抗氧化应激和抗炎症作用机制。许多研究报道了COS的抗炎性质，研究了COS对LPS刺激的小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7细胞的影响，发现添加COS可引起LPS诱导的TNF-α和IL-6分泌及其mRNA表达呈剂量依赖性降低，COS可以降低LPS诱导的NO分泌，小鼠RAW 264.7细胞培养基中添加COS逆转了TNF-α介导的IL-6和NO含量的降低，从而表明COS的抗炎作用是通过调节TNF-α进而降低NO的产生实现的[23]。另有研究表明，经预处理的低分子量硫酸化壳寡糖可抑制因LPS诱导RAW 264.7细胞中NO、IL-6和TNF-α炎性介质的产生，硫酸化壳寡糖可通过核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信号通路活化的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)信号通路调节抑制LPS诱导的巨噬细胞中IL-6和TNF-α的产生[24]。通过确定虹膜睫状体(iris ciliary body，ICB)的临床评分和形态来评估COS的作用，COS的治疗以剂量依赖的方式显著减轻了ICB的临床评分，有效降低炎症介质(TNF-α、iNOS等)的表达[25]。壳聚糖被证实可部分抑制肥大细胞中白细胞介素-8(IL-8)和TNF-α的分泌，表明壳聚糖具有降低过敏性炎症反应的潜力，肥大细胞的过敏反应中产生的炎性因子涉及许多神经炎症性疾病，壳聚糖及其衍生物可能有助于预防或减轻其中的一些并发症[26]。

有研究表明，不同片段大小的甲壳素可刺激Toll样受体2(TLR2)、甘露糖受体和炎症细胞因子的表达，差异性激活NF-κB信号通路和脾脏酪氨酸激酶(spleentyrosine kinase，Syk)，通过多形核白细胞促进吞噬作用产生白细胞介素-1(IL-1)和血小板衍生生长因子，并通过成纤维细胞产生IL-8介导免疫反应。研究指出，几丁质具有炎症调节作用，中等大小甲壳素和小甲壳素都能刺激小鼠腹膜巨噬细胞的TNF-α产生，但大甲壳素片段是惰性的[27]。还有研究报道了壳聚糖和季铵化壳聚糖(quaternized chitosan，HTCC)对LPS刺激的人牙周膜细胞中白细胞介素-1β(IL-1β)和TNF-α产生的影响，壳聚糖抑制了IL-1β和TNF-α的产生而HTCC增加了IL-1β和TNF-α产生[28]。目前相关的研究报道甚少，需要进一步探讨。

2.2 通过抑制NF-κB信号通路降低NO产生

NO是生物体内的一种气体信号分子和活性氮自由基，介导许多生物功能，如宿主防御、神经传递、神经毒性和血管舒张[29]。NO是由L-精氨酸向L-瓜氨酸转化过程中生成的，并通过一氧化氮合成酶(NOS)内源合成，共有3种类型的NOS异构体，包括神经元一氧化氮合成酶(nNOS)、内皮一氧化氮合成酶(eNOS)和iNOS。巨噬细胞来源的NO在生理、病理和炎症反应中起重要作用，活化的巨噬细胞对抗原增殖的抑制作用部分归因于NO。巨噬细胞在通过分泌NO和促炎细胞因子如TNF-α和IL-6的免疫应答中起重要作用，然而NO的过量产生导致各种疾病如动脉粥样硬化、恶性肿瘤、类风湿性关节炎、组织损伤和败血性休克发生概率的增加[30]。

NF-κB是活化的B细胞与核因子的免疫球蛋白κ轻链增强子元件的结合，具有这种特异性结合活性的蛋白质在大部分细胞中都具有多种调控功能[31]。转录因子NF-κB在慢性炎症中起重要的作用，对参与免疫应答反应的基因表达的调节起关键作用。除了其在先天免疫中的作用外，NF-κB信号传导可以控制细胞增殖和凋亡，NF-κB激活通常导致抗凋亡基因的上调，从而提高细胞存活能力以抵御炎症反应。已经证实NF-κB诱导调节免疫应答的细胞因子(如TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8)，以及黏附分子并导致白细胞募集到炎症部位[32]。在典型的激活途径中，兴奋性信号可以通过Toll-样受体(Toll-like receptors，TLR)、IL-1受体、肿瘤坏死因子受体和抗原受体介导，这些受体接收刺激后导致了IκB-激酶复合物的激活，从而活化NF-κB[33]。

在小鼠胰腺β细胞系MIN6中硫酸化壳寡糖(COS-S)对过氧化氢诱导的氧化损伤的保护作用机制的报道中，COS-S显著抑制了NO产生，同时抑制iNOS的活性及其mRNA表达以及NF-κB蛋白p65的蛋白水平[34]。这些结果表明，COS-S的抗氧化能力可能与其阻断了NF-κB信号通路有关。在小鼠的RAW 264.7细胞氧化应激损伤模型中，使用COS可以减少LPS诱导引起的炎症反应，降低了LPS诱导的NF-κB/p65糖基化修饰的水平。这是因为NF-κB糖基化修饰水平的下调可能有助于NF-κB/p65核移位和降低NF-κB通路的活化，进而下调了炎性细胞因子的基因表达[35]。有研究表明，酶消化高分子质量壳聚糖制备的低分子质量壳聚糖寡糖(LM-COS)对体内和体外过敏反应和过敏性哮喘具有抗炎作用，LM-COS对哮喘模型小鼠中卵清蛋白(OVA)诱导的肺部炎症具有保护作用，口服LM-COS导致白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-13(IL-13)、TNF-α的mRNA和蛋白水平显著降低[36]。这表明LM-COS可以消除体内哮喘症状，这些作用可以由其介导抑制OVA诱导的气道炎症期间Th2型细胞因子的表达。此外，NF-κB调节促炎细胞因子的表达，LM-COS抑制由免疫球蛋白E(IgE)-抗原复合物刺激的RBL-2H3细胞中NF-κB的活化[37]。

2.3 通过抑制MAPK信号通路降低NO的生成

MAPK通路是促炎症反应中的重要细胞内信号传导通路之一，骨髓分化因子-88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)途径介导MAPK的活化。MAPK包含3个亚家族：细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases，ERK)、c-jun-氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNK)和p38丝裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases，p38 MAPK)[38]。这些激酶通过降解IκB-α来激活下游的NF-κB调节炎症基因的表达。LPS刺激的巨噬细胞中MyD88和β干扰素TRI结构域衔接蛋白(TRIF)依赖性信号通路的激活是通过iNOS表达获得的[39]。Toll样受体4(TLR4)是识别LPS并通过2种基本途径释放炎症介质的细胞外受体，即MyD88途径和包含TIR结构域的衔接子诱导TRIF途径。研究发现，COS通过JNK抑制LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞中iNOS的产生[40]。

有研究报道了COS在LPS诱导的仔猪败血症中的保护作用，发现COS不仅减缓了仔猪肠道器官功能障碍，还可以提高LPS注射后的存活率。为了进一步剖析机制，研究了肠道中的嗜中性粒细胞和血清中的TNF-α和IL-1β等几种促炎症标志物的变化规律，发现COS处理的仔猪中这些细胞因子的含量显著降低；由LPS诱导引起的仔猪败血症，其GSH和CAT的消耗增加，且丙二醛含量升高，导致了氧化还原失衡，而COS可逆转这一氧化还原失衡[41]。此外，由LPS激活的信号通路，如JNK和p38，在COS处理后得到缓解，这些结果表明，COS通过对MAPK信号通路的抑制作用实现其对LPS诱导的小鼠氧化应激模型的保护作用[42]。有报道研究了COS对LPS诱导的N9小胶质细胞中NO产生的影响，结果发现，COS预处理可通过抑制活化的小胶质细胞中的iNOS表达来抑制NO产生，COS可抑制LPS诱导的p38 MAPK和ERK的磷酸化；COS预处理也可以抑制NF-κB和激活蛋白-1的活化[43]。这些结果进一步说明壳聚糖及其衍生物的抗氧化应激作用是通过抑制MAPK和NF-κB信号通路的活化，引起iNOS表达下调，进而抑制NO的生成实现的。

2.4 通过调节脂类代谢发挥抗氧化应激作用

低密度脂蛋白(LDL)的氧化与冠状动脉粥样硬化有关。LDL氧化后高水平的胆固醇氧化产物对内皮细胞有毒性[44]。巨噬细胞在炎症反应中的保护作用主要通过清除免疫调节因子如TNF-α和IL-1等刺激因子促进了LDL与内皮细胞、平滑肌的结合。抗氧化剂通过抑制单核细胞黏附分子的上调，增强人体中LDL的抗氧化能力，从而发挥免疫作用。高密度脂蛋白可以抑制由细胞因子诱导的内皮细胞黏附分子的表达[45]。许多资料报道了壳聚糖具有降低胆固醇含量的效应，研究表明，壳聚糖及其衍生物对血清中甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇含量的降低有着显著作用[46]。有报道证实，饲喂小鼠12周γ射线照射的壳聚糖，其体内总胆固醇含量显著低于对照组[47]。摄入低分子质量的壳聚糖可以抑制血液透析患者中常见的血清白蛋白的氧化，进而降低与尿毒症相关的氧化应激。此外，羧化壳寡糖能够抑制细胞膜脂质和蛋白质的自由基介导的氧化，同时降低小鼠巨噬细胞中脂质氢过氧化物的水平和羰基碳含量，从而发挥其抗氧化作用。

3 小 结

综上所述，壳聚糖及其衍生物主要通过抑制NF-κB和MAPK信号通路降低NO的生成，调节体内免疫因子发挥其抗氧化及抗炎性功能，也可通过调节脂类代谢发挥其抗氧化应激的功能。

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