鱼类病毒诱导细胞凋亡机制研究进展

周广舟，孙彦鹤，郭爽爽

(河南工业大学生物工程学院，河南郑州 450001)

现代水产养殖业在过去的30年中取得了巨大发展，并成为世界范围内主要的经济和农业增产途径之一，但近来细菌、真菌、病毒和其他病原侵染引起的大量水生动物性疫病严重制约着该产业的发展，而且每年还不断有新的病原体出现[1]。对病毒性病原体来说，鉴于其主要隐藏在宿主细胞内并利用细胞代谢系统进行复制和扩散，开发能正常干扰病毒复制而又不影响宿主细胞结构和功能的抑制或治疗措施尚无成功，致使水生动物病毒性疾病的暴发成为目前水产养殖业面临的难解课题之一[2]。目前，世界各地不同研究小组已从养殖或野生水生动物体内寻找并鉴定出包括虹彩病毒、呼肠病毒、水生双RNA病毒等多种病毒，并证明它们是多类水生动物传染性疫病的主要病原和引起水产动物产量和价值降低的主要元凶[3]。

细胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)大多是细胞在遇到内外环境因素刺激后而采取的一种主动的受基因调控启动的有序死亡方式，涉及到多种细胞因子和调控机制，常见的有细胞凋亡(apoptosis)、自噬(autophagy)等[4]。宿主细胞可以利用凋亡和自噬过程限制入侵病毒的扩增和传播[5]，反过来病毒也可能在该过程中产生更多的子代病毒或利于自身的释放[6]。除此之外，近年来还有在病毒感染过程中有新的细胞程序性非典型死亡方式如细胞坏死性凋亡(necroptosis)、焦亡(pyroptosis)等的报道[7-8]，都提示病毒与宿主细胞之间的关系是复杂而多样的。在水生动物病毒学研究领域，也有多科病毒在感染细胞过程中诱导细胞凋亡并发挥特定功能的报道[9]。近几年还有一些鱼类病毒如鲤春弹状病毒(Spring viraemia of carp virus,SVCV)、虹彩病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)等诱导细胞自噬的研究报道[10-11]。这些研究实践为未来深入探讨水生动物病毒的致病机制和开发可能的防控措施提供了理论基础。本文就水生动物病毒感染后诱导的细胞程序性死亡机制研究进展进行综述，以期为今后水生动物病毒与宿主细胞的关系研究积累更多资料。

1 水生动物病毒诱导的细胞凋亡研究

作为一种常见的用来清除非必需或受损细胞器且受到高度调控的细胞程序性机制，凋亡在维持机体细胞正常发育、动态平衡等方面发挥重要作用[12]。常见的凋亡路径包括外源性(死亡受体)和内源性(线粒体)通路两种，往往都涉及到多种半胱氨酸蛋白酶的激活和切割。在近年来对水生动物病毒的研究中，发现多科病毒具有诱导细胞凋亡的能力，并在特定细胞内执行不同的功能。

1.1 Bad介导的细胞死亡途径——水生双RNA病毒(Aquabirnavirus)

研究最广泛和深入的鱼类病毒之一——传染性胰腺坏死病毒(Infectious pancreatic necrosis virus，IPNV)即是该病毒属的重要成员。尽管在20世纪40年代就在养殖鳟鱼中发现了相关疫病，但直到1955年前后才最终根据其感染组织病理变化进行了定名。IPNV宿主范围广泛能感染多种鱼类，并引起不同程度的侵染病症，带来巨大的经济损失。

研究发现，IPNV在感染鱼类细胞CHSE-214后6 h即能检测到典型的凋亡形态变化，细胞逐渐变圆并进入凋亡程序，8 h后已有超过60%受染细胞出现DNA片段化现象[13]。进一步的研究显示，IPNV感染时能激活凋亡前体蛋白Bad基因表达，下调Mcl-1因子。在斑马鱼细胞系ZLE中单独过表达IPNV的结构蛋白基因VP3后也能导致Bad基因上调，进而引起线粒体膜电位降低，激活起始和效应caspases，最终引起细胞死亡[14]。这表明IPNV可以通过其蛋白诱导细胞凋亡。

最近有关IPNV的研究显示，IPNV在感染后其几个蛋白基因对大西洋鲑I型干扰素具有显著的拮抗效应，其中VP2、VP3、VP4和VP5拮抗IFNa1启动子活性，而VP1却能诱导IFNa1的产生[15]。这种凋亡晚期标志现象提示作为一种应对IPNV复制的防御机制，细胞凋亡能有效导致细胞死亡从而不会长时间维持病毒的复制循环，进而减少子代病毒的产生。但实际上在感染的CHSE-214细胞中仍会产生高滴度的IPNV，表明有部分细胞能逃避凋亡并维持病理状态从而导致生成更多的子代病毒粒子。上述结果体现了IPNV感染细胞后的复杂性。

1.2 线粒体介导的细胞死亡通路——乙型野田村病毒(Betanodavirus)

该病毒属的代表株——神经坏死症病毒(Nervous necrosis virus,NNV)是一种RNA病毒，主要侵染鱼类脑、视网膜和脊髓等部位，对仔(幼)鱼的致死率可达95%，能感染至少40余种海水和淡水鱼类，并不断有新的宿主范围报道[16]。

研究表明，该科病毒主要是通过线粒体介导的细胞死亡方式诱导细胞死亡。如赤点石斑鱼神经坏死病毒(Red spotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV)感染细胞后在早期复制阶段(24 h内)诱导线粒体ROS产生，激活氧化应激反应和内质网应激[17]。在感染的早中期，胞内线粒体膜电位(MMP)下调，而特异性抑制剂BKA可以阻止其下调和细胞色素c的释放。进一步研究发现，RGNNV感染能引起细胞抗凋亡蛋白基因Bcl-2表达下调，反过来Bcl-2家族成员zfBcl-xL和zfMcl-1a均能较强的抑制RGNNV引起的细胞坏死，抑制率分别达到90%和93%[18]。但RGNNV感染的多个caspases酶活包括caspases-3，8，9等与对照组相比并无明显差别，广谱性caspases抑制剂处理也对病毒诱导的细胞死亡没有显著影响[18]。这些结果都提示，乙型野田村病毒能在不同细胞系分别激活caspase依赖和非依赖的两种细胞死亡途径。其中RGNNV主要激活caspase非依赖的死亡通路，而如巨石斑鱼神经坏死病毒(Greasy grouper nervous necrosis virus,GGNNV)等在海鲈细胞里能引起caspase依赖的细胞死亡[19]。

1.3 p38 MAPK/ROS介导的细胞死亡途径——正粘病毒(Orthomyxovirus)

传染性鲑鱼贫血病病毒(Infectious salmon anemia virus,ISAV)即是该病毒属的主要代表，其基因组由八个单股负义RNA分子构成，至少编码10个病毒蛋白，主要侵染大西洋鲑鱼，引起鱼体贫血、腹水、内脏器官和皮肤等点状出血，可导致受染鱼急性病变或处于长期带毒状态。

最近的研究显示，ISAV感染S.salar白细胞后能激发氧自由基的产生，并通过p38 MAPK信号通路介导凋亡前体蛋白的激活和表达并最终引起细胞凋亡。Olavarría V H等[20]在ISAV感染的鲑鱼细胞系SHK-1内，利用抑制剂SB203580阻断caspase-3酶活后发现，病毒激活的p38 MAPK仍能导致细胞出现凋亡。用夹竹桃麻素(apocynin)处理抑制NADPH氧化酶活性后，caspase-3活性与未感染组相当。但在感染72 h后，病毒滴度有16%的降低，表明细胞超氧阴离子的水平影响病毒粒子的成熟。但由于Apocynin只阻断NADPH氧化酶而不干扰p38 MAPK的活性，对ISAV感染引起的p38 MAPK和NAPDH氧化酶激活之间的关系仍然未知，后续需要继续开展ISAV感染的细胞和分子生物学机制研究。

1.4 ROS介导的细胞死亡途径——水生呼肠病毒(Aquareovirus)

水生呼肠病毒为无包膜病毒，基因组通常由11个节段的线性双股RNA构成，草鱼呼肠病毒(Grass carp reovirus,GCRV)作为其中致病力最强的毒株之一[21]，是引起草鱼出血病的主要病原。近年来在草鱼肾脏细胞系CIK的感染试验表明，GCRV能诱导细胞凋亡和胞内氧化损伤[22]。在感染早期(24 h前)，胞内TNF-α释放进而激活caspase-8和下游的caspases酶(如caspase-3等)，导致细胞典型的内源性和外源性凋亡的发生。但需注意的是，caspases酶的激活不依赖于病毒的复制，而且感染72 h后可能由于细胞的大量死亡，caspase 3、8、9酶活还会下降。以上结果提示，GCRV感染早期诱导细胞凋亡，而细胞氧化应激反应发生在感染后期(72 h～96 h)，且后者影响病毒的复制循环。事实上，氧化应激(主要是ROS和RNS的产生)是很多病毒感染的特征[23]，所以GCRV感染采用这样的策略导致宿主细胞的死亡机制也并不鲜见。

1.5 ERK细胞死亡途径——蛙虹彩病毒(Ranavirus)

虹彩病毒科成员是一类大DNA病毒，能感染包括甲壳类、贝类、昆虫、鱼类、两栖类和爬行类生物，具有广泛的宿主范围并对水产养殖业造成巨大损失[24]。该科病毒目前分成5个属，诱导细胞死亡机制复杂，其中的信号通路机制仍有很多未知。

大口鲈鱼病毒(Largemouth bass virus,LMBV)是一种属于虹彩病毒蛙病毒属(Ranavirus)的成员，Huang X等[25]对其研究发现，LMBV能诱导具典型内源和外源性特征的细胞凋亡，包括出现凋亡小体、caspases酶激活和细胞色素c释放等。此外还发现，PI3K和ERK细胞信号通路不仅参与到病毒自身的复制过程中，还跟病毒诱导的细胞凋亡有关。用LY294002抑制剂阻断PI3K信号通路后，病毒滴度会严重降低，同时细胞凋亡程度加剧，表明PI3K通路对LMBV的感染是必需的。而抑制剂U0126抑制ERK信号通路后虽能降低子代病毒的产量，但病毒诱导的细胞自噬也被抑制，这与另一种蛙病毒属成员——新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)感染细胞后激活的ERK信号通路的作用类似[26]，提示ERK信号通路可能是一个潜在的抗虹彩病毒分子靶点。但需注意的是，LMBV感染后，细胞的p53、AP-1、NF-κB和CREB等因子的启动子活性均显著降低，这与其他蛙虹彩病毒的不同。

1.6 Fas介导的细胞死亡途径——细胞肿大虹彩病毒(Megalocytivirus)

条石鲷虹彩病毒(Rock bream iridovirus,RBIV)是虹彩病毒科的另一个病毒属——肿大细胞病毒属成员，感染鱼体后能引起脾肿大和各内脏器官嗜碱性细胞的增多。目前，尽管对条石鲷应对RBIV的抗病毒免疫机制尚未明晰，但RBIV侵染过程中细胞内凋亡相关因子如穿孔素、颗粒酶、Fas配体和caspases酶等已在不同宿主内得到鉴定。学者们对RBIV在不同致病力条件下感染条石鲷后细胞凋亡相关因子进行了研究，并发现了Fas介导参与的细胞死亡信号通路。

研究发现，RBIV感染后若鱼体放置到26℃水温条件下，致死率往往能达到100%。而如果感染后放置在23℃ 1周后移至17℃水温条件下，致死率仅能达到18%(30 d后)[27]。在高致病组，检测发现鱼体的穿孔素、颗粒酶、Fas配体和caspase-9表达量在感染8 d时都呈显著上调，而凋亡抑制因子1(IAP1)仅在感染第1天和第4天时呈高表达，第8天和第10天的表达量与对照组没有明显差别。而在低致病组，试验鱼体内穿孔素、颗粒酶和Fas配体的表达量直到感染30 d后仍显著高于对照组，Fas和caspase-8，9，3表达没有统计学显著差异。低致病组试验鱼体内IAP1的表达量也比对照组的要高(第10天、第20天和第22天)。IAP1的上调抑制了RBIV感染后的凋亡反应，但目前仍不清楚这种抑制效应对鱼类生存是否有利。另外，Fas及其配体和caspase-8等虽短时间内维持高表达，但不足以激活下游的凋亡分子。后续更深入地从分子水平研究病毒蛋白和宿主凋亡调节因子可为揭示RBIV的侵染机制提供更多信息。

2 水生动物病毒诱导的细胞非典型凋亡研究

新加坡石斑鱼虹彩病毒株SGIV感染石斑鱼宿主细胞EAGS后并未呈现典型的细胞凋亡特征，仅表现一种称为类凋亡的细胞死亡方式，表现为胞质空泡化、线粒体和内质网肿胀、caspases酶活缺陷等，但无经典的凋亡小体形成和DNA片段化等特征出现[26]。当用SGIV感染非宿主细胞——胖头鱥肌肉细胞系FHM后，细胞出现典型的凋亡特征。此外还发现，SGIV感染EAGS细胞早期，细胞ERK1/2磷酸化，病毒可以利用激活的ERK信号途径逃避宿主IFN诱导的抗病毒免疫反应，进而利于自身的复制和传播。用抑制剂U0126抑制ERK信号通路延迟了细胞病变的发生，降低了SGIV诱导的非凋亡型细胞死亡和病毒复制量。上述这些数据表明，ERK信号途径参与了SGIV病毒的感染和细胞非凋亡型死亡过程。

3 鱼类病毒诱导的细胞自噬研究

在水生动物病毒学领域有关病毒感染细胞引起自噬及后续效应的研究尽管不多，但最近几年还是有了一定的发展[28]，学者们对几株鱼类病毒诱导的自噬对细胞的生存和病毒的复制以及二者之间的相互关系进行了深入地探索。

3.1 鱼类弹状病毒SVCV诱导的细胞自噬

目前对鱼类弹状病毒诱导细胞自噬的研究相对于其他科病毒的研究要深入得多，主要是基于对哺乳动物弹状病毒的前期理解基础上开展的工作。哺乳动物弹状病毒，如水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)，感染果蝇后首先能诱导细胞出现抗病毒自噬免疫反应[29]，自噬小体数量增多，自噬相关基因(如LC3-II、Atg8等)表达上调，自噬蛋白的表达会提高子代病毒的复制量。灭活的病毒粒子或单独的病毒糖蛋白(glycoprotein)也能激活自噬反应，已经确认VSV G蛋白可作为一种病原相关分子模式被果蝇细胞受体Toll-7识别并启动抗病毒自噬保护反应[30]，表明VSV诱导的细胞自噬对病毒的复制不是必须的。

近年来，对鱼类弹状病毒的代表株——鲤春弹状病毒SVCV的研究显示，其G蛋白启动细胞的自噬效应对病毒自身的基因组RNA复制和子代复制却是必须的[10]，且在病毒感染过程中有助于清除受损的线粒体DNA从而维持细胞生存。由于自噬具有细胞特异性，不同细胞自噬的分子机制不同，且即使是同一种细胞，自噬的调控机制也可能不同[31]。上述不同研究组使用的细胞系不同，可能是导致弹状病毒感染不同细胞后自噬效应不一的原因。Wang等[32]对鳢鱼水疱病毒(Snakehead fish vesiculovirus,SHVV)感染鳢鱼细胞系SSN-1的研究也检测到明显的自噬性信号，而且发现诱发的细胞自噬能抑制病毒的复制。这些结果都为未来开展更深入的鱼类病毒与宿主细胞相互作用关系奠定了基础。

3.2 传染性鲑鱼贫血病毒诱导的细胞自噬

传染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)作为正黏病毒科的一员，近年发现其感染鱼类细胞后细胞出现典型的自噬特征，包括双层膜样自噬小体和LC3蛋白的点状聚集(荧光显微镜观察)等[33]。自噬抑制剂3-MA处理能减少重组表达质粒LC3-GFP在胞内的聚集，且能降低病毒载量，显示自噬过程可能在子代病毒复制循环中发挥一定的作用。

3.3 鱼类虹彩病毒(Fish iridovirus)诱导的细胞自噬

虹彩病毒诱导的细胞自噬近年有了新的进展，Qi H等[34]对5株不同脊椎动物虹彩病毒感染鳜鱼鱼苗细胞系MFF-1诱导细胞自噬的状况进行分析的结果表明，石斑鱼虹彩病毒(Grouper iridovirus,GIV)和大口鲈鱼虹彩病毒LMBV感染后能诱导细胞出现自噬小体，但在传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)、中国大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,CGSIV)和虎纹蛙病毒(Tiger frog virus,TFV)感染的细胞内未显现类似现象。免疫印迹分析能检测到LC3蛋白的转换，荧光显微镜观察能检测到LC3蛋白的点状聚集，后续药物测试显示自噬主要在GIV和LMBV的感染细胞内起抗病毒作用，提示未来可能开发基于自噬调节的抗虹彩病毒感染新措施。

有趣的是，Li C等[11]利用ISKNV在鲑鱼脑细胞系CPB的感染试验中发现，ISKNV能诱导细胞出现完整的自噬流，呈现典型的LC3蛋白转换及点状聚集和大量自噬小泡等特征。药物处理细胞后分析发现，雷帕霉素诱导的细胞自噬有助于ISKNV复制和蛋白合成，但不利于胞外病毒产量的增加。相反，自噬抑制剂氯喹(CQ)处理能提高ISKNV感染细胞上清液的病毒滴度。这些结果与Qi H等[34]利用ISKNV感染MFF-1细胞的状况完全不同，这可能与使用不同的细胞系有关，进而导致是否诱导自噬存在差异。

4 展望

在过去的几十年间，人们已从人工养殖或野生鱼体中分离出诸如虹彩病毒、弹状病毒、呼肠病毒和水生双RNA病毒等多科病毒的大量代表株。在对它们感染特性鉴定、病毒蛋白分析和基因组结构解析的基础上，病毒感染后引起的病毒与水产动物宿主细胞之间的关系问题越来越成为学者们研究的焦点，并有可能成为厘清病毒致病机制的主要切入点。

很多病毒感染细胞后细胞出现凋亡现象，这种凋亡过程可能是细胞为应对病毒侵染而采取的自保措施，从而避免更多的邻近细胞死亡。但就病毒而言，一方面可能与宿主细胞Bcl-2等抗凋亡蛋白家族成员相互作用，阻止细胞更早死亡从而延长自身的持续性感染时间，扩增更多的子代病毒粒子；另一方面病毒也可能推动细胞更快的凋亡裂解从而利于自身的释放和扩散。不同病毒株感染后诱导的细胞凋亡功能不一，需要依据具体的感染模型来分析。鱼类病毒感染引起的细胞凋亡的功能研究目前已有一些进展，但需要更多深入研究实例来支撑细胞凋亡在病毒感染中扮演的角色。

相对于凋亡，鱼类病毒诱导的细胞自噬是最近几年新兴的研究领域，相关方面的研究进展也较少，仅在几株病毒上有初步的研究尝试。尤其是自噬作为一种具有复杂调控机制的细胞程序性自主行为，在不同的细胞里差别很大，同一鱼类病毒株在侵染不同宿主细胞后其胞内自噬的发生及差异机制研究等尚未涉及，急需在未来有更多这方面的报道。此外，目前已有较多病原体同时诱导细胞凋亡和自噬的报告，对两者之间的“串话”(Crosstalk)关系也进行了较深入地探讨[35]。但水产动物病毒诱导的细胞自噬与凋亡之间的调控关系尚未见报道。更深入地探讨鱼类病毒诱导的细胞程序性死亡机制有助于这些问题的解决，并可以为阐明这些病毒的致病机理和开发相应的防控技术提供理论基础。