在肝移植术中应用调节性T细胞的研究进展

丁非凡，曾 仲

（昆明医科大学第一附属医院器官移植科，云南 昆明 650500）

调节性T细胞（Treg）是T淋巴细胞群中表达CD4、CD25、Foxp3等特异性表面标志物的淋巴细胞亚群，其可以有效地抑制自身反应性T细胞的功能及增殖。1995年，日本学者Sakaguchi等[1]的研究中首次发现CD4+CD25+Treg，并指出CD4+CD25+Treg的免疫调节作用是维持自身免疫耐受的关键。自此以后，国内外众多学者便致力于对Treg的研究。大量的研究表明，Treg不仅在维持动物体自身免疫耐受和免疫防御中具有重要的作用，其在肿瘤的发展、移植耐受、维持免疫平衡等方面也具有至关重要的作用。以至于有学者认为，以CNI（钙神经蛋白抑制剂）为主的免疫抑制剂有可能被Treg增强免疫疗法所取代。

1 Treg的概述

根据Treg来源的不同，可将其分为来源于胸腺的天然型Treg（natural Treg，nTreg）和通过抗原刺激产生的诱导型 Treg（induced Treg，iTreg）。

nTreg在胸腺中发育成熟后，可进入患者的外周淋巴组织，其具有较强的免疫耐受性，可防止患者发生自身免疫性疾病。iTreg可分为Th3细胞和Trl细胞[2]。其中，Th3细胞可分泌转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF-β），Trl细胞可分泌白细胞介素10（interleukin 10，IL-10）。有研究表明，在胸腺发育成熟的nTreg进入外周血后，具有较强的自身免疫耐受性，可预防自身免疫性疾病的发生，而iTreg产生的同种异体抗原能够更好的延长肝脏移植物的存活时间[3-5]。

nTreg和iTreg的增殖和分化依赖于TGF-β和白细胞介素2（interleukin 2，IL-2）细胞因子的刺激。成熟的TGF-β能够与TβR（TGF-β受体）相结合，使果蝇抗生物皮肤生长因子蛋白2（Drosophila mothers against decapentaplegic protein 2，Smad2）和果蝇抗生物皮肤生长因子蛋白3（Drosophila mothers against decapentaplegic protein 3，Smad3）被磷酸化，被磷酸化的Smad2、Smad3与果蝇抗生物皮肤生长因子蛋白4（Drosophila mothers against decapentaplegic protein 4，Smad4）结合后，可附着在DNA上的Smad结合位点，从而可调控下游基因的转录[6]。同时，Tet1（清除记忆基因1）和Tet2（清除记忆基因2）可通过TGF-β以及IL-2信号通路被募集至FoxP3基因座上，维持Foxp3基因调节区的去甲基化状态，从而维持Treg的稳定性。

IL-2信号通路的主要作用是调节人体内Treg的平衡。肝移植术后患者体内如果缺少IL-2或者IL-2的受体（α链/CD25和β链/CD122），可使Treg的数量明显降低。由于nTreg自身并不能转录及分泌IL-2，因此，其只能完全依赖于旁分泌的方式来调节Treg的数量。经大量的研究证实，IL-2可以使信号转导子与转录激活子5（signal transduction and activator of transcription5，STAT5） 被 磷酸化，从而诱导和分化成熟的Treg。

袁渊等[7]的研究表明，外周血中睾酮素的水平与Treg的数量呈正相关。临床实践证实，进行肾脏移植术后，男性患者体内的雄激素可直接抑制效应T细胞，从而减少其对肾脏移植物的排异反应。而女性在月经期间，其Treg水平的升高、细胞免疫（cell-mediated immunity）水平的降低则可能与外周血中孕激素水平的异常升高有关。

2 Treg表面标志物

CD25（cluster of differentiation 25，分化群25）曾被视为Treg特异性表面标志物。但有研究表明，CD25还可以在活化的T淋巴细胞表面进行诱导性表达，从而造成了无法区分CD4+CD25+调节性T细胞和CD4+CD25+活化T细胞的困境。Roncador等[8]的研究表明，可以将Foxp3（forkhead box P3，插头盒蛋白P3）作为CD4+CD25+调节性T细胞特异性表面标志物。

Foxp3是人类Fox（Forkhead box，插头盒）基因家族中的一员。Fox家族是脊椎动物叉头样转录因子的总称，与细胞生长发育的调控有关。由于Foxp3具有在Treg内表达的特性，因此，只能在破坏Treg细胞膜的情况下检测Foxp3的水平。由此可见，Foxp3并不是Treg有效的表面标志物。

FONTENOT等[9-10]人的研究表明，CD127（IL-7受体）可在Treg表面下调表达，可将CD127low作为Treg的另一个特异性标志物。此外，该项研究还表明，外周血中Treg的水平与其受到CD127调控的程度呈负相关。也就是说，CD127若在Treg表面进行表达，会降低Treg的功能。这一发现解决了需要破坏Treg细胞膜检测Foxp3水平的困境。

除此之外，Treg非特异性表面标志物还有PD-1（Programmed death1，程序性死亡蛋白 1）、CTLA4（Xytotoxic T lymphocyte-associated protei-4，细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4）、TNF（Tumor necrosis factor，肿瘤坏死因子）、TGF-β（Transforming growth factor β，转化生长因子β）、IFN-γ（Interferon γ，γ 干扰素）和以GARP（Glycoprotein A repetition，糖蛋白A）为主的重复序列蛋白。

3 Treg的作用机制

Treg能够分泌TGF-β。有研究表明，TGF-β可与NK（自然杀伤细胞）表面的TGF-β1R Ⅱ（转化生长因子β1Ⅱ型受体）结合，通过TGF-β-Smad信号通路使Smad2被磷酸化，从而诱导P15INK4B（抑癌基因）和P21WAF1/cip1（靶向抑癌基因）的转录[11]。临床实践证实，P15INK4B、P21WAF1/cip1均能够有效地抑制NK细胞的繁殖。

Treg和活化的T细胞均能够上调IL-2R（IL-2受体）的表达[12-14]。IL-2（白细胞介素2）是一种糖蛋白，能够与IL-2R的复合体﹝包括CD25 IL-2Rα链（白细胞介素2受体α链抗体）、CD122 IL-2Rβ链（白细胞介素2受体β链抗体）、CD132 IL-2Rγ链（白细胞介素2受体γ链抗体）﹞相结合。CD25 IL-2Rα链与CD122 IL-2Rβ链、CD132 IL-2Rγ链结合，可提高IL-2R对IL-2的亲和力。CD122 IL-2Rβ链和CD132 IL-2Rγ链对细胞内信号转导具有重要的作用，通过信号转导可激活PI3K/Akt (磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B通路)、RTPK（酪氨酸蛋白激酶受体信号转导）、MAPKs (丝裂原活化蛋白激酶通路)、JAK/STAT（转录因子激活通路）等，从而进一步激活NK细胞、单核巨噬细胞和中性粒细胞。有研究表明，Treg与效应性T 细胞竞争性结合IL-2，从而可抑制其他免疫细胞的增殖和活化。

Treg分泌的CTLA4与协同刺激信号B7-1分子和B7-2分子具有较高的亲和力，可以与其他效应T细胞表面的CD28竞争性结合APC表面的相同分子，从而干扰CD28的共刺激信号。同时，CTLA4还能下调APC表面B7分子的表达，从而降低APC的刺激能力[15-16]。有研究表明，在CD4+CD25+效应T细胞中转染CTLA4表达质粒，能够使效应T细胞获得免疫抑制的功能[17]。如果向CD4+CD25+效应T细胞中转染Foxp3表达质粒则不会使效应T细胞出现免疫抑制的功能。

大量的研究表明，Treg可以通过释放颗粒酶/穿孔素等途径起到抑制免疫反应的作用。颗粒酶属于外源性的丝氨酸蛋白酶，其是由CTLs（细胞毒淋巴细胞）和NK（自然杀伤细胞）共同释放的细胞浆颗粒。这些细胞浆颗粒中含有颗粒质酶、穿孔蛋白等。Treg通过释放颗粒酶，可以有效地激活CD4+T细胞、CD8+T细胞，使未成熟的DC（树突状细胞）自然凋亡。

4 Treg的体外扩增

Treg的免疫抑制功能在临床中具有重要的应用价值。在临床应用中需要较大数量的Treg，故如何在体外诱导过程中产生大量功能稳定、表型稳定的Treg具有重要的研究意义。

进行Treg体外扩增的方式包括抗原特异性体外扩增与非特异性体外扩增。抗原特异性体外扩增是指在进行体外扩增时所产生的Treg具有抗原的特异性。相关的研究表明，具有抗原特异性的Treg可向靶器官迁移，并可在靶器官中发挥抑制作用，从而可降低肿瘤、感染的发生率。也有研究表明，具有抗原特异性的Treg能够有效地降低肝移植术后小鼠GVHD的发生率，并可避免肝移植术后小鼠对肝脏移植物发生急性排斥反应[18]。

Feng等[19]的研究中，曾使用同种异树突状细胞和PDE3抑制剂对小鼠进行体外扩增，其使用同种异树突状细胞的主要原因是：1）树突状细胞提供了同种异体的特异性抗原。2）树突状细胞可提供Treg扩增所需要的CD28传导信号。

非特异性体外扩增是目前较为成熟的Treg体外扩增的方式。大量的研究表明，进行非特异性体外扩增时，TGF-β和 IL-2能够促进Treg中幼稚祖细胞源分化成为Treg，但由此产生的Treg具有免疫无能性。有研究表明，刺激TCR（T细胞抗原受体）可激活具有免疫无能性的Treg。刺激TCR的常用方法为在TCR中加入抗CD3的抗体、抗CD28的抗体、抗原呈递细胞（antigen presenting cell，APC）抗原的同时，加入10～2000 U/mL高浓度的外源性IL-2。

Zhang等[20]的研究表明，在对TCR进行刺激时，TGF-β1/Fc融合蛋白与西罗莫司均能够诱导未成熟的CD4+CD25+Foxp3—T细胞分化成为成熟的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞。Lu等[21]的研究表明，由TGF-β诱导的CD4+CD25—T淋巴细胞可以在CD3抗体、CD28 抗体存在时，将ATRA (all-trans-retinoic acid，全反式维A酸)转换成为CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞。这一研究结果已经在动物实验中得到证实，且证实其能够有效地能够延长患有GVHD的小鼠的生存期。

但目前，对肝移植术后患者进行Treg的非特异性体外扩增仍存在较大的“缺陷”。肝移植术后患者若存在炎症反应，Treg可转化为Th17（辅助性T细胞）。相关的研究表明，Th17是一种能够分泌IL-17、IL-22等促炎性因子的辅助性T细胞。这两种细胞因子均可加重患者的局部炎症反应。

5 Treg在肝移植术中的应用

目前，临床上常采用肝移植术对肝癌终末期患者进行治疗。临床实践证实，影响肝移植术后患者肝脏移植物存活率的主要因素为其是否发生急性排斥反应。近年来，免疫抑制剂的更新迭代及临床应用，虽然有效地降低了肝移植患者急性排斥反应的发生率，但却提高了其不良反应的发生率。

相关的调查数据显示，肝移植术后患者完全接受肝脏移植物的占比为进行肝脏移植术总人数的25%～33%，这与其受体内CD4+CD25+的异常表达有关[22]。Tapirdamaz等[23]的研究表明，肝移植术后患者肝脏移植受体的CTLA-4基因存在+49A/+6230G风险等位，可提高其发生急性排斥反应的发生率。

Demirkiran等[24]的研究表明，肝移植术后患者发生急性排异反应时其体内Treg的数量低于未发生排异反应的患者，这说明，肝移植术后患者肝脏移植物的存活率与其体内Treg的数量呈正相关。目前，医学界内仅有对造血干细胞移植术后患者进行体外扩增Treg以抑制其急性排异反应的临床研究。Trzonkowski P等[25]的研究中，曾为骨髓移植术后发生GVHD的患者采用体外扩增CD4+CD25+CD127lowTreg的方法进行治疗。该研究证实，对骨髓移植术后患者进行CD4+CD25+CD127lowTreg体外扩增治疗可减少其免疫抑制剂的用量，有效地缓解其临床症状。Brunstein等[26]在一项研究中对23例脐带造血干细胞移植术患儿进行CD4+CD25+CD127lowTreg体外扩增治疗，有效地降低了其GVHD的发生率。

6 结论

进行体外扩增Treg或在进行自体血液分离Treg后再将Treg回输入患者体内很可能是对接受肝移植术后发生急性排斥反应患者进行治疗的有效方法。目前，这两种治疗方法均处于研究阶段，且相关研究的对象大多为在无菌环境中生长的啮齿类动物。与在无菌环境中生长的啮齿类动物相比，人类的免疫系统更为复杂。目前，对肝移植术后患者采用体外扩增Treg的治疗方式来抑制其发生急性排斥反应的临床研究还处于空白状态，Treg在人体内通过何种方式或由何种物质诱导生成还不明确，此类课题均有待于进一步的研究。