响应曲面法优化酵母β-葡聚糖酶解工艺及产物分析

范红梅，汪建明*，刘力

1(天津科技大学 食品工程与生物技术学院，天津,300457) 2(北京彬原原商贸有限公司，北京,101111)

酵母β-葡聚糖是从啤酒酵母的细胞壁中提取的聚合物,具有增强哺乳动物免疫活力，抗感染，促进伤口愈合的功能，是一种生物效应应答剂[1-4]。但是酵母β-葡聚糖特殊的分子结构导致其溶解性差，降低了其在食品中的应用。为解决这一问题，目前国内外的学者对酵母β-葡聚糖进行了化学改性、物理改性和生物改性的研究[5-7]。生物改性方法主要是通过酶解作用降低酵母β-葡聚糖的分子量，从而提高溶解度。KERY[8]等人曾对酵母β-葡聚糖进行水解，但得率较低。酵母β-葡聚糖酶作用于酵母β-葡聚糖的糖苷键，使其糖苷键断裂，降低酵母β-葡聚糖分子的聚合度，分子量减小，提高了酵母β-葡聚糖的溶解度。酵母β-葡聚糖酶包含的特异性内切酶和外切酶分别作用于酵母β-葡聚糖分子的不同位点，将其降解为还原糖或寡糖[9]。酶解的效果受多种因素的影响，为了使酵母β-葡聚糖酶发挥最大活性，本试验利用β-葡聚糖酶对酵母β-葡聚糖进行水解，考察了底物浓度、酶活浓度、反应温度和溶液pH对酶解反应的影响,并对比了酵母β-葡聚糖和水溶性酵母β-葡聚糖的结构和热稳定性的差异，为拓宽酵母β-葡聚糖的应用范围提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

酵母β-葡聚糖：唐山拓普生物科技有限公司；β-葡聚糖酶，酶活浓度为6 200 U/mL：丹尼斯克(中国)有限公司；标准酵母葡聚糖：Sigma公司；柠檬酸、磷酸氢二钠、苯酚等均为国产分析纯试剂。

1.2　仪器与设备

离心机，湘仪离心机仪器有限公司；RE-52AA循环水式旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；Lab-1B-50E真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；752型紫外可见分光光度计，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；HH-S4恒温水浴锅，郑州长城科工贸有限公司；GZX-9240MBE鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；IS50傅里叶红外光谱仪，美国尼高利；Q50热重分析仪，美国TA公司。

1.3　试验方法

1.3.1酵母β-葡聚糖的酶解工艺

称取酵母β-葡聚糖，分散在9 mL的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，水浴锅预热10 min后加入β-葡聚糖酶。初始条件为底物质量浓度1 g/dL、酶活浓度0.15 U/mL、温度45 ℃、pH4.0。反应1.5 h后沸水浴5 min灭酶活，3 500r/min 离心20 min，取上清液，得样品，测可溶性总糖和还原糖。

1.3.2单因素试验和响应面试验设计

其他条件不变，考察底物质量浓度：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 g/dL；酶活浓度：0.05、0.10、0.15、0.20、0.30和0.40 U/mL；温度：35、40、45、50、55和60 ℃；pH：3.0、3.5、4.0、4.5和5.0对水溶性酵母β-葡聚糖得率的影响。

依据单因素试验和Box-Behnken的响应面设计，确定水溶性酵母β-葡聚糖得率最大的条件，并进行验证试验，试验表如表1。

表1　响应面试验因素水平表Table 1　Independent variable values

1.3.3酶解液中可溶性总糖含量的测定

按照苯酚-硫酸法[11]测定总糖的含量。

1.3.4酶解液中还原糖含量的测定

按照DNS法[10]测定还原糖的含量。

1.3.5水溶性酵母β-葡聚糖得率的计算[12]

反应结束，酶解液经3 500 r/min离心20 min，取1 mL上清液测其总糖和还原糖，计算水溶性酵母β-葡聚糖得率(公式(1))：

(1)

式中：m总为酶解液中总糖含量，g；m还为酶解液中还原糖含量，g；m0为添加酵母β-葡聚糖的质量，g。

1.3.6酵母β-葡聚糖与水溶性酵母β-葡聚糖性质分析

1.3.6.1热重分析

将酵母β-葡聚糖和酶解后的水溶性酵母β-葡聚糖样品置于热重分析仪上，从室温升至800 ℃，升温速率为10 ℃/min，样品质量为3～4 mg，铂坩埚，载气为高纯度氮气，气流量60 mL/min。

1.3.6.2红外光谱分析

将酵母β-葡聚糖和酶解后水溶性酵母β-葡聚糖分别与KBr按质量比1∶150混合压片，进行红外扫描，分辨率为4 cm-1，扫描次数为16次，扫描区间4 000～400 cm-1。

2　结果与分析

2.1　水溶性酵母β-葡聚糖得率的影响因素

2.1.1底物质量浓度对水溶性酵母β-葡聚糖得率的影响

固定酶浓度为0.15 U/mL，温度为45 ℃，溶液pH为4.0，分别在0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 g/dL的梯度下，测得水溶性酵母β-葡聚糖得率(图1)。由于β-葡聚糖酶的作用，酵母β-葡聚糖糖链发生断裂，使不溶性的酵母β-葡聚糖水解为可溶性多糖。底物质量浓度为1.0 g/dL时，水溶性酵母β-葡聚糖得率最大，当底物质量浓度大于1.0 g/dL时，得率降低，这是由于β-葡聚糖具有强吸水性和持水性，随着反应体系中底物浓度的增大，溶液黏度也不断增大，阻碍酶与底物接触。因此，底物质量浓度选择1.0 g/dL为宜。

图1　底物质量浓度对水溶性酵母β-葡聚糖得率的影响Fig.1　Effects of substrate concentration on water-solubleyeast β-glucan yield

对每一个质量浓度梯度的3组重复实验数据进行分析，结果见表2。图1标注的显著性差异由Duncan法分析得到。由表2及图1可知，底物质量浓度为0.5 g/dL和2.0 g/dL的两个处理间无显著性差异，其他处理间存在显著性差异。

表2　底物质量浓度的方差分析Table 2　The analysis of variance table of substrateconcentration

2.1.2酶浓度对水溶性酵母β-葡聚糖得率的影响

固定底物质量浓度为1.0 g/dL，温度为45 ℃，溶液pH为4.0，分别在酶浓度0.05、0.10、0.15、0.20、0.30和0.40 U/mL的梯度下，测得水溶性酵母β-葡聚糖得率见图2。由图2可知，水溶性酵母β-葡聚糖得率随着酶浓度的增大先增大后减小，在酶浓度为0.15 U/mL时可得率最大。随着酶浓度的继续增大，酶作用于已水解的葡聚糖，从而产生了大量的二糖、单糖等，导致水溶性酵母β-葡聚糖得率降低。因此，酶浓度选择0.15 U/mL为宜。

图2　酶浓度对水溶性酵母β-葡聚糖得率的影响Fig.2　Effects of enzyme concentration on water-solubleyeast β-glucan yield

对每一个浓度梯度的3组重复实验数据进行方差分析，结果见表3，图2标注的显著性差异由Duncan法分析得到。由表3及图2可知，酶浓度为0.05 U/mL和酶浓度为0.4 U/mL的两个处理间无显著性差异，酶浓度为0.05 U/mL和酶浓度为0.4 U/mL的两个处理间无显著性差异，酶浓度为0.1 U/mL和酶浓度为0.2 U/mL的两个处理间无显著性差异，其他处理间存在显著性差异。

表3　酶浓度的方差分析Table 3　The analysis of variance table of enzymeconcentration

2.1.3温度对水溶性酵母β-葡聚糖得率的影响

固定底物质量浓度1.0 g/dL，酶活浓度0.15 U/mL，溶液pH为4.0，分别在温度35、40、45、50、55和60 ℃的梯度下，测得水溶性酵母β-葡聚糖得率见图3。由图3可知，在45 ℃时水溶性酵母β-葡聚糖得率最大。随着温度升高，酶的活性降低，水溶性酵母β-葡聚糖的得率降低。

图3　温度对水溶性酵母β-葡聚糖得率的影响Fig.3　Effects of temperature on water-soluble yeastβ-glucan yield

对每一个温度梯度的3组重复实验数据进行分析，结果见表4，图3标注的显著性差异由Duncan法分析得到。由表4及图3可知，温度为50 ℃的处理与温度为35 ℃和40 ℃的处理均无显著性差异，其他处理间存在显著性差异。

表4　温度的方差分析Table 4　The analysis of variance table of temperature

2.1.4pH对水溶性酵母β-葡聚糖得率的影响

固定底物质量浓度为1.0 g/dL，酶活浓度0.15 U/mL，温度为45 ℃，分别在溶液pH为3.0、3.5、4.0、4.5和5.0的梯度下，测得水溶性酵母β-葡聚糖得率见图4。由图4可知，pH为4.0时水溶性酵母β-葡聚糖得率最大，当pH大于或小于4.0时影响酶促反应速率，水溶性酵母β-葡聚糖得率下降。

图4　pH对水溶性酵母β-葡聚糖得率的影响Fig.4　Effects of pH on water-soluble yeast β-glucan yield

对每一个pH梯度的3组重复实验数据进行分析，结果见表5，图4标注的显著性差异由Duncan法分析得到。由表5及图4可知，pH对水溶性酵母β-葡聚糖得率影响的处理间均存在显著性差异。

表5　pH的方差分析Table 5　The analysis of variance table of pH

2.2　响应面法优化酵母β-葡聚糖酶解工艺

2.2.1响应面模型分析

为了优化酶解反应工艺，在单因素试验结果的基础上，选取底物质量浓度、酶活浓度、温度和pH的最佳试验范围。依据Box-Behnken中心组合设计原理，以水溶性酵母β-葡聚糖得率为响应值，利用Design-Expert 8.0软件设计了4因素3水平的响应面试验，共有29个试验点。试验设计和结果见表6，方差分析见表7。

表6　Box-Behnken设计方案及响应值结果Table 6　Design and experimental results of RSM

利用软件进行方差分析，可得到模型的二次多项回归方程：

Y=39.90+0.96A+0.63B-0.90C+1.43D+1.95AB+0.68AC+0.88AD+0.50BC-0.57BD-2.5×10-3CD-2.85A2-2.44B2-2.24C2-1.98D2

式中：Y为水溶性酵母β-葡聚糖得率,%;A为底物浓度,g/dL;B为酶活浓度,U/mL;C为温度,℃;D为pH。

该回归模型的方差分析结果见表7，模型相关系数R2=0.919 8，响应面回归模型F值为11.46，显著性检验p<0.000 1，表明模型极显著；失拟项p为0.196 4>0.05，不显著，表明实验结果和数学模型拟合良好，因此可用该数学模型推测实验结果。变异系数CV值为2.86%，变异系数较低，说明模型置信度高，响应值水溶性酵母β-葡聚糖得率的变化有97.14%来源于变量(底物质量浓度、酶活浓度、温度和pH)，因此能够较好地反映真实实验值。各变量因素对水溶性酵母β-葡聚糖得率影响程度的大小顺序依次为pH>底物质量浓度>温度>酶活浓度。

表7　回归模型方差分析Table 7　Variance analysis of regression model

注：**表示p<0.01，差异极显著；*表示p<0.05，差异显著。

2.2.2因素交互作用分析

通过Design-Expert 8.0软件对影响水溶性酵母β-葡聚糖得率的各因素之间的交互作用进行分析，绘制响应面曲线图，见图5～10。通过图可清晰地反映出响应曲面的最高点以及各因素范围间的交互作用对响应值的影响。据此确定酵母β-葡聚糖的最佳酶解工艺条件。

由曲面弯曲的程度可知，底物浓度对可溶性多糖得率的影响最为显著，其次是酶活浓度、温度和pH。此外，酶活浓度和底物质量浓度，pH和温度，pH和酶活浓度以及pH和底物浓度的相互作用较为显著，等高线为椭圆形。

图5　底物质量浓度和酶活浓度对水溶性酵母β-葡聚糖得率的交互影响Fig.5　Substrate concentration and enzyme activityconcentration on the yield of water-soluble yeast β-glucan

图6　底物质量浓度和温度对水溶性酵母β-葡聚糖得率的交互影响Fig.6　Substrate concentration and temperature onthe yield of water-soluble yeast β-glucan

图7　底物质量浓度和pH对水溶性酵母β-葡聚糖得率的交互影响Fig.7　Substrate concentration and pH on the yield ofwater-soluble yeast β-glucan

图8　酶活浓度和温度对水溶性酵母β-葡聚糖得率的交互影响Fig.8　Enzyme activity concentration and temperatureon the yield of water-soluble yeast β-glucan

图9　酶活浓度和pH对水溶性酵母β-葡聚糖得率的交互影响Fig.9　Enzyme activity concentration and pH on theyield of water-soluble yeast β-glucan

图10　温度和pH对水溶性酵母β-葡聚糖得率的交互影响Fig.10　Temperature and pH on the yield of water-solubleyeast β-glucan

2.2.3最佳优化条件及验证试验

通过RSREG Procedure分析，可以产生一个最优值，即底物浓度为1.18 g/100 mL，酶活浓度为0.16 U/mL，温度为43.43 ℃，pH值4.19。在此条件下水溶性酵母β-葡聚糖得率为40.5939%。

为了再次验证响应面分析法的可靠性，选取条件底物质量浓度为1.14 g/dL，酶活浓度为0.16 U/mL，温度为44 ℃，pH为4.20，实际测得水溶性酵母β-葡聚糖得率39.89%，比回归模型预测理论值低0.55%(小于5%)。因此响应面分析优化得到的酶解工艺条件准确可靠。段会轲等人研究了利用木霉菌株产的β-1,3-葡聚糖酶对酵母葡聚糖进行酶解，其可溶性多糖得率为52%，与本研究结果接近。本研究所用原料为商品用酵母β-葡聚糖，多糖含量为80%，所用酶亦不相同，因而与前人的研究结果略有差异。

2.3　酶解时间对可溶性多糖得率的影响

在底物质量浓度为1.14 g/100 mL，酶活浓度为0.16 U/mL，温度为44 ℃，pH为4.2的条件下，研究酶解时间对水溶性酵母β-葡聚糖得率的影响，结果如图11所示。水溶性酵母β-葡聚糖得率随着酶解时间的增长而呈现出先迅速升高后下降的趋势，酶解时间1.5 h时，水溶性酵母β-葡聚糖得率最大，延长时间，水溶性酵母β-葡聚糖得率下降。随着酶解时间的增长，葡聚糖酶不仅作用于不溶性酵母β-葡聚糖，也同时作用于已溶的多糖，导致水溶性酵母β-葡聚糖得率下降。由此确定酶解时间为1.5 h。

图11　酶解时间对水溶性酵母β-葡聚糖得率的影响Fig.11　Effects of times on water-soluble yeast β-glucan yield

对每一个浓度梯度的3组重复实验数据进行分析，结果见表8，图11标注的显著性差异由Duncan法分析得到。由表8及图11可知，酶解时间对水溶性酵母β-葡聚糖得率影响的处理间均存在显著性差异。

表8　酶解时间的方差分析Table 8　The analysis of variance table of time

2.4　酵母β-葡聚糖与水溶性酵母β-葡聚糖的性质分析

2.4.1热重分析

为了研究酵母β-葡聚糖与水溶性酵母β-葡聚糖的热稳定性与热分解作用，进行了热重分析(TGA分析)。热重分析法是测量物质的质量与温度关系。在加热过程中得到的样品累积量的积分型曲线即是TG曲线，它是由TGA分析得到的。样品质量的变化率由DTG曲线表示。

图12　酵母β-葡聚糖和水溶性酵母β-葡聚糖的热重分析图谱Fig.12　TGA curves of yeast β-glucan and water-solubleyeast β-glucan

图13　酵母β-葡聚糖和水溶性酵母β-葡聚糖的微分热重分析图谱Fig.13　DTG curves of yeast β-glucan and water-solubleyeast β-glucan

图12和图13分别显示的是酵母β-葡聚糖和水溶性酵母β-葡聚糖的热重分析图谱和微分热重分析图谱。酵母β-葡聚糖和水溶性酵母β-葡聚糖均有两个失重峰。酵母β-葡聚糖的第一个失重峰是由于水分损失所致的重量损失，出现在50 ℃左右，失重率5.58%。第二个失重峰出现在316～388 ℃，最高峰出现在360 ℃左右，此温度称为酵母β-葡聚糖的特征分解温度，这表示样品内的挥发组分析出并且燃烧，样品质量损失率为94%。这说明酵母β-葡聚糖在该温度范围内发生了剧烈的分解反应。

同酵母β-葡聚糖相比，水溶性酵母β-葡聚糖的TG曲线同样在50 ℃左右出现失重峰，失重率为6.47%。水溶性酵母β-葡聚糖的第二个失重峰出现在306～399 ℃，特征分解温度为356 ℃左右，样品质量损失率为88%。酵母β-葡聚糖和水溶性酵母β-葡聚糖的特征分解温度分别为360 ℃和356 ℃，终止分解温度分别为780 ℃和740 ℃。热重分析结果表明两者的热稳定性差异不大，酶解对酵母β-葡聚糖的热稳定性基本无影响。

2.4.2红外光谱分析

为了研究酵母β-葡聚糖与水溶性酵母β-葡聚糖的结构差异，进行了红外光谱分析。红外光谱可以分析多糖的糖苷键构型，确定多糖的结构与种类。酵母β-葡聚糖与水溶性酵母β-葡聚糖的红外吸收图谱如图14所示。

图14　酵母β-葡聚糖和水溶性酵母β-葡聚糖的红外光谱图Fig.14　IR Spectrum of the sample of yeast β-glucanand water-soluble yeast β-glucan

由图14可以看出，酵母β-葡聚糖和水溶性酵母β-葡聚糖的红外光谱图基本一致，图谱显示在890 cm-1处有特征峰，表明了其糖苷键为β构型；2 920 cm-1的特征峰说明样品具β-1,3键；1 460～1 042 cm-1附近为多糖的吸收带；在3 431 cm-1处有吸收峰可以认为是O—H的伸缩振动峰；810 cm-1附近没有吸收峰证明酵母β-葡聚糖和水溶性酵母β-葡聚糖的单糖组成成分无甘露糖。综上，酵母β-葡聚糖和可溶性酵母β-葡聚糖的分子构象相同。

3　结论

通过单因素和响应面实验确定酵母β-葡聚糖的酶解条件：底物质量浓度为1.14 g/100 mL，酶活浓度为0.16 U/mL，温度为44 ℃，pH为4.2，在此条件下水溶性酵母β-葡聚糖得率为39.89%，比回归模型预测理论值低0.55%(小于5%)，表明该工艺条件准确可靠。此外，各变量因素对水溶性酵母β-葡聚糖得率影响程度的大小顺序依次为pH>底物质量浓度>温度>酶活浓度。

通过热重分析表明，酵母β-葡聚糖和水溶性酵母β-葡聚糖的特征分解温度分别为360 ℃和356 ℃，终止分解温度分别为780 ℃和740 ℃。酵母β-葡聚糖和水溶性酵母β-葡聚糖的热稳定性差异不大，酶解对酵母β-葡聚糖的热稳定性基本无影响。通过红外光谱分析表明，酵母β-葡聚糖与水溶性酵母β-葡聚糖具有相似是红外光谱，其糖苷键型为β构型，且具有β-1,3键，分子构象相同。

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