PTPN12蛋白表达下调与原发性肝细胞癌患者复发和预后关系研究*

隆绍平，邓世群，赵世元

(1.广西百色市人民医院检验科，广西百色　533000；2.南宁市西乡塘区石埠卫生院检验科，南宁　530008； 3.广西医科大学附属民族医院检验科，南宁　530001)

肝癌(HCC)在我国发病率和致死率很高，每年约有30万例新发肝癌，占全球50%以上。肝癌发展迅速、易转移，是目前治疗最困难、预后最差的恶性肿瘤之一。肝癌的发生发展是多因素作用、多阶段发展而来的，寻找与肿瘤发生、发展相关的肿瘤标志物是提高肝癌治疗效果的关键[1～4]。细胞内信号转导通路依赖激酶和磷酸酶的磷酸化。非受体蛋白酪氨酸磷酸酶12(PTPN12)是一种重要的抑癌基因，属于酪氨酸磷酸酶家族，能正向调节RAS等通路[5，6]。最近，有越来越多的证据表明，表达降低PTPN12发生在多种人类恶性肿瘤，包括乳腺癌、结肠癌、卵巢癌和食管鳞状细胞癌[7，8]。然而，对PTPN12和肝癌的预后意义未见报道。本研究我们采用免疫组化法检测肝细胞肝癌和癌旁肝组织PTPN12蛋白表达水平，采用受试者工作特征曲线(ROC曲线)进行分析，并结合临床资料分析其与HCC临床病理特征的关系及在肝癌复发及预后的意义。

1　材料和方法

1.1研究对象收集2013年2月～2015年10月广西医科大学附属民族医院，经CT 诊断、彩超、化验，行肝癌切除术，术后肝组织病理证实为肝癌患者120例，其中包括原发性术前和根治性切除或术后抗肿瘤治疗的病例，切除肿瘤组织有相关的随访资料。男性102例，女性18例。平均年龄为49.5岁。平均随访时间为32.5个月(中位数为25个月，范围为1～86个月)。肿瘤特异性生存(CSS)被定义为肝癌手术和死亡的间隔时间或最后一次观察。存活的患者，最后一次随访中对数据进行核查，剔除其他原因导致的死亡病例。无复发生存率(RFS)被定义为从手术日期直到检测到肿瘤复发、死亡或末次随访评估。临床病理特征包括年龄、性别、肝炎史、血清甲胎蛋白(AFP)水平(≤20ng/ml/>20ng/ml)、肝硬化的存在、肿瘤的数量(单瘤/多瘤)、肿瘤大小(≤5cm/>5cm)、肿瘤分化程度(分化良/高分化/未分化)、肿瘤分期(Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ)、血管侵犯程度(天/有)、复发(无/有)情况和生存状态[(死于肝癌(剔除其他原因死亡)/活着]。肿瘤分期是根据美国癌症/国际抗癌联合委员会的肿瘤淋巴结转移(TNM)分类系统定义[16]。患者术后第1年每3个月随访1次，术后第2年每6个月随访1次，术后第3年每年随访1次。用超声、CT或MRI检查肿瘤复发(包括肝内复发或转移)。

1.2试剂和仪器一抗稀释液购于美国Abcam公司，使用前按1∶100稀释，二抗及DAB显色试剂购于丹麦envision DAKO公司。

1.3方法

1.3.1标本处理：手术切除的肝组织采用预冷生理盐水清洗，之后将癌组织和癌旁组织切成 2mm×2mm大小，并分成3份，将2份置于冻存管中，经液氮速冻，1～2 h后转入-80℃冰箱冻存备用。另1份置于4 ml/dl多聚甲醛溶液中固定。

1.3.2免疫组化染色：经4 ml/dl多聚甲醛溶液固定后的癌组织与癌旁组织样本，用石蜡包埋，并切成5 μm厚的连续切片。二甲苯脱蜡，用不同浓度的乙醇脱水，3 ml/dl H2O2室温湿盒孵育10min清除内源性过氧化物酶，高温加热，低温沸腾继续加热8 min(1L，pH 6.0，0.4 g枸橼酸/3 g枸橼酸钠混合溶液)进行抗原修复，10 ml/dl正常山羊血清室温湿盒封闭30 min，滴加一抗稀释液(美国 Abcam公司，1∶100稀释)4℃过夜，用缓冲液洗涤后滴加二抗(丹麦envision DAKO公司)室温湿盒30 min，DAB显色约2 min。经苏木素复染，水洗，返蓝，不同浓度乙醇脱水，二甲苯透明2次，封片剂封片，镜检，拍照；选用已知阳性肝癌组织切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照，染色步骤严格按照产品说明书进行。

1.3.3免疫组化评价标准[9]：PTPN12表达结果判定由3名病理医师盲法阅片。对PTPN12蛋白表达阳性为胞质棕黄色颗粒。根据阳性细胞百分比及细胞染色强度进行评估，阳性细胞百分比规定为0，1(1%～25%)，2(26%～50%)，3(51%～75%)，4(76%～100%)；细胞染色强度(0无染色，1淡棕黄色;2棕黄色：3棕褐色)。表达系数：0分为阴性；1～3分为弱阳性表达，≥4为强阳性表达。本研究将<4分为低表达，≥4为高表达。

1.4统计学分析 统计分析采用SPSS13.0统计软件包进行数据分析。采用χ2检验进行PTPN12表达与肝癌患者临床病理特征之间的关系。单因素、多因素生存分析、相应的风险比(HR)和95%可信区间采用Cox风险回归模型。组间两两比较采用t检验，多组间数据比较采用方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1PTPN12蛋白在肝癌和癌旁肝组织中的表达PTPN12蛋白表达阳性在胞质出现棕黄色颗粒。120例病例中，PTPN12低表达有67例(55.83%)，PTPN12高表达有53例(44.17%)。见图1。

2.2PTPN12表达与肝癌患者临床病理特征的关系见表1。阐明PTPN12表达与肝癌患者临床病特征之间的关系。肝癌组织中PTPN12表达在不同性别组、年龄组、多瘤组、病毒感染组、肝硬化组、肿瘤大小组、肿瘤分化程度及分级组间表达差异均无统计学意义(均P>0.052)；PTPN12表达降低与肿瘤复发呈负相关(P=0.005)，肝癌PTPN12表达和血清AFP表达相关(P=0.048)。

表1 PTPN12表达与肝癌患者临床病理特征的关系[n(%)]

A.肝癌细胞PTPN12表达正常，胞质有很强弥漫性PTPN12染色；B.肝细胞癌PTPN12表达降低，所有癌细胞PTPN12呈弱阳性染色；C.肝细胞癌PTPN12表达阴性；D.癌旁肝组织PTPN12正常表达，所有的癌细胞呈强阳性。

图1免疫组化法检测PTPN12蛋白在肝癌和癌旁肝组织中的表达(×400)

2.3120例原发性肝细胞癌PTPN12表达和临床病理特征变量的单因素分析及Cox分析见表2。肝癌的临床病理特征(AFP水平、肿瘤大小、肿瘤多样性、临床分期、血管浸润和复发)与患者生存率单因素分析有显著影响(P<0.05)，生存评估发现肝癌患者肝癌PTPN12表达下调与癌症特异性生存率有关(Cox回归模型，风险比：0.321，95%可信区间：0.212～0.467，P<0.001)。肝癌患者肝癌细胞PTPN12表达降低与患者生存期缩短有高度显著的相关性。肝癌患者PTPN12表达降低在I/II期或III/IV阶段预后较差(P<0.05)。

2.4PTPN12表达与影响生存率预后因素的Cox多因素分析见表3。通过肝癌临床特征(包括AFP水平、肿瘤大小、肿瘤的多样性，阶段和血管侵犯等)和PTPN12表达与患者生存率的单因素分析及Cox风险模型分析，我们发现肝癌PTPN12表达降低影响癌症特异性生存率和肝癌患者的无复发生存率的预后因素(P<0.001)。经过独立的血清AFP水平、肿瘤大小、临床分期、血管侵犯的多样性分析，AFP水平、肿瘤大小、肿瘤多样性和血管浸润被认为是癌症特异性生存率和无复发生存率的独立预测因子(P<0.05)。

表2 120例原发性肝细胞癌PTPN12表达和临床病理特征变量的单因素分析(Cox回归)

表3 PTPN12 表达与影响生存率预后因素的Cox多因素分析

3　讨论

现代医疗尽管对肝癌监测和治疗策略有所改善，但由于肝癌复发和远处转移率高，肝癌的预后仍然不理想[10]。目前，现有的临床分期和组织学分级系统的建立成为肝癌的有用预后指标。然而，患者相同的临床分期和肝细胞癌的组织学分级在肝癌复发和转移常常表现出相当大的差异。肿瘤异质性、遗传和表观遗传改变的积累可能导致肝癌个体的预后变异性[11]。之前的研究发现肝癌许多基因异常表达，但这些基因还不能在每个阶段或对预后有效评估。因此，寻找一种能够识别肿瘤复发和辅助风险评估新的分子标记物成为当今肝癌治疗的主题。

PTPN12属于蛋白质酪氨酸磷酸化家族，位于7q11.23，是PTP家族成员，是一种新型抑癌基因[12]，乳腺癌组织中缺失PTPN12磷酸酶活性肿瘤抑制基因导致出现乳腺上皮细胞异常的腺泡形态转化。近年来，已发现乳腺癌、非小细胞肺癌、肺癌、食管癌等癌组织中PTPN12表达下调，并与其不良预后相关[13]。然而，PTPN12蛋白表达在肝癌和肝癌临床病理的预后意义尚未有报道。因此，我们采用基于免疫组织化学法检测PTPN12在肝癌组织和癌旁组织中的表达，评估其在肝癌发生发展和预后的潜在影响。

本研究我们发现，与癌旁肝组织相比，肝癌组织中PTPN12蛋白表达差异有统计学意义，肝癌组织PTPN12蛋白表达下降。在乳腺癌和食管鳞状细胞癌中也发现了类似的结果[14]。乳腺癌组织PTPN12蛋白表达为32.0%，癌旁乳腺组织PTPN12蛋白表达为11.3%[15]。此外，免疫印迹结果表明，食管癌组织PTPN12蛋白表达明显低于食管癌旁组织中。我们研究PTPN12在肝癌组织表达降低与肿瘤的复发密切相关，提示PTPN12可以抑制肝癌的形成和增殖。此外，对PTPN12表达与临床病理特征的相关性分析表明，低表达PTPN12与肝癌淋巴结转移有关，这一结果与文献[16]报道一致。本研究结果可能支持PTPN12作为一个肿瘤抑制基因在肝癌的发生和发展中发挥关键作用。

我们实验结果表明，PTPN12蛋白在人肝癌组织中表达下调或缺失，肝癌复发可能与PTPN12蛋白低表达有关。PTPN12蛋白表达缺失可能作为一种新的肝癌预后的不利因素，本研究结果可能给肝癌患者术后肿瘤治疗预后评估提供帮助。

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