T2DM并发NAFLD患者血清Nesfatin- 1水平变化及相关影响研究*

张　梅，李林娟，冯旭霞，李　亚，薛亚妮

(1.延安大学附属医院东关分院综合内科，陕西延安　716000；2.延安大学附属医院 a.CT/MR诊断科；b.呼吸内科，陕西延安　716000)

目前全球罹患非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的人数已经占到20%[1]，而2型糖尿病(T2DM)患者罹患NAFLD的严重程度与危险程度比单纯的NAFLD患者更高。流行病学研究报告指出，T2DM患者中罹患NAFLD的几率高达21%～78%[2]。NAFLD是一种肝实质细胞脂肪变性后出现的脂肪堆积疾病，目前临床对该病的发病机理仍然存在争议。脂肪在体内的作用不仅仅是存储能量，更重要的是内分泌作用，脂肪细胞分泌出的脂肪因子参与人体的各种新陈代谢过程，包括胰岛素抵抗、T2DM，高凝状态、血脂紊乱等。其中Nesfatin- 1是一种调节肝糖与胰岛素分泌的胃肠调剂肽，能有效的减轻体质量、抑制食物摄入、降低血糖等作用[3]。但是限于目前临床研究T2DM对NAFLD患者血清水平Nesfatin- 1的变化影响并不多，所以本次研究旨在对Nesfatin- 1的生理作用进行阐明，望能在今后的临床工作中提供可靠的依据。

1　材料与方法

1.1研究对象选取2014年1月～2016年1月我院内分泌科收治的T2DM患者300例作为本次研究的对象，根据患者是否并发非酒精性脂肪肝将其分为T2DM伴有NAFLD组150例与T2DM不伴有NAFLD组150例，另外选取同期在医院进行健康体检的150例志愿者作为对照组(NGT组)。病例纳入标准：T2DM：患者均满足1999年WHO对糖尿病的诊断，并满足以下标准：①患者出现糖尿病标准，且任意时间段的血糖≥11.1 mmol/L；②患者空腹血糖≥7.0 mmol/L；③口服葡萄糖耐量试验患者2 h的血糖≥11.1 mmol/L；以上诊断不包含1型糖尿病与特殊糖尿病。NAFLD：所有患者均满足2002年中华医学会肝病学修订的NAFLD诊断标准[4]，满足以下诊断1～5项或是满足第6项/7项中任一项均可判定为NAFLD，①患者无饮酒史或每周饮酒的酒精含量不超过40 g；②血转氨酶以谷氨酸氨基转移酶增高明显，或伴有铁蛋白、尿酸、γ- 谷氨酰转肽酶增高；③自身有易患病因素包括2型糖尿病、肥胖、高血脂及女性等；④除原发病的临床表现外，还出现肝区疼痛及乏力等症状；⑤无自身免疫性疾病、病毒性肝炎、药物性肝炎、胃肠外营养疾病等；⑥影像学检查结果可确诊；⑦肝脏组织学的变现典型。

三组研究对象Nesfatin- 1水平与一般情况的比较具体如下：T2DM组男性86例，女性64例，年龄51.4±7.6岁，病程6.7±1.1年；T2DM- NAFLD组男性92例，女性58例，年龄50.9±8.1岁，病程6.3±1.5年；NGT组男性80例，女性70例，年龄51.3±7.8岁。三组受试者的性别比、年龄及病程比较差异均无统计学意义(P值分别为0.37，0.73和0.94)，具有可比性。

1.2试剂和仪器本次研究使用试剂盒由武汉优尔生生物工程有限公司提供，低温高速台式离心机由美国 ICE公司提供，ZD- 420电热恒温水浴箱由杭州中拓仪器有限公司提供，日立7020全自动生化分析仪由日本HITACHI公司提供，-40℃低温冰箱由美国FORMA公司提供，酶标仪由美国BIOTEK公司提供，GC- 911γ放射免疫计数仪由北京顺杰欣隆科技公司提供，DEM- Ⅲ型自动酶标洗板机由北京拓普分析仪器有限公司提供，YD- HY8微量震荡器由北京中诺远东科技公司提供。

1.3方法所有研究对象均于检查前禁食8 h以上，于第二日清晨对研究对象进行空腹采血，采用葡萄糖氧化酶法对其空腹血糖进行测定，高压液相离子层析法对其糖化血红蛋白进行测定，放射免疫法对其空腹胰岛素进行测定，连续监测法对其肝功能进行测定，比色法对血脂四项(总胆固醇、总三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇)进行测定。另外取2 ml静脉血标本对其进行低温高速离心，待血清分离后放置于-40℃进行统一检测。

血清Nesfatin- 1水平采用双抗夹心酶联免疫吸附法进行测定，本次研究使用试剂盒由武汉优尔生生物工程有限公司提供，分别向96孔微板(已经进行了人NES1抗体包被)加入标准品与标本，再向其中加入生物素化的NES1抗体进行免疫复合物合成。将尚未结合的抗体进行清洗，再加入有HRP标记的亲和素，随后洗净后进行显色。底物在氧化物酶的作用下会变成蓝色，经酸性环境后变成黄色。微孔中通过黄色体现出的深浅度对NES1浓度进行判断，两者属于正相关关系[5]。

记录所有患者的身高体重，并计算身高体质指数，具体公式BMI=体质量(kg)/身高2(m2)。记录患者的空腹血糖(FBG)、空腹血浆胰岛素(FIN)，并使用稳态模型胰岛素抵抗指数计算公式对胰岛素抵抗指数进行计算，计算公式：胰岛素抵抗指数=空腹血胰岛素×空腹血糖/22.5[6]。

2　结果

2.1三组研究对象Nesfatin- 1水平及相关生化指标的比较见表1。本研究对T2DM，T2DM- NAFLD和NGT组的各种生化指标和Nesfatin- 1水平进行测定。三组对比具有显著性差异的指标结果如下：BMI，TG，ALT和INS水平，T2DM组与NGT组显著低于T2DM- NAFLD组，差异均有统计学意义(均P=0.00)；FBG，HbAlc，LDL- C，HOMA- IR和血清Nesfatin- 1水平：T2DM组与T2DM- NAFLD组显著高于NGT组，差异均有统计学意义(均P=0.00)。

表1 三组研究对象Nesfatin- 1水平及相关生化指标的比较

注：▲与T2DM组比较，P<0.05；▼与NGT组比较，P<0.05。BMI：身体质量指数，FBG：空腹血糖，HbA1c：糖化血红蛋白，TG：三酰甘油，TC：胆固醇，HDL- C：高密度脂蛋白胆固醇，LDL- C：低密度脂蛋白胆固醇，ALT：谷氨酸氨基转移酶，INS：胰岛素，HOMA- IR：稳态模型胰岛素抵抗指数。

2.2T2DM组患者Nefastin- 1和病程的相关性分析T2DM组患者与T2DM- NAFLD组患者的血清Nesfatin- 1水平和病程系正态分布，采用Pearson系数对患者进行相关性分析，结果显示呈现中度相关性(r=-0.421，P<0.05)。

2.3T2DM组患者出现脂肪肝的回归分析见表2。将脂肪肝作为T2DM患者的因变量，将BMI，TG，HDL- C，ALT，INS，HOMA- IR和血清Nesfatin- 1水平作为自变量，采用Logistic回归分析进行统计学处理，结果发现BMI，TG，血清Nesfatin- 1水平和脂肪肝的发生有密切的联系(r值分别为-0.402，-0.273，-0.284；P值分别为0.01，0.00和0.00)。

表2 T2DM组患者出现脂肪肝的回归分析

3　讨论

3.1NAFLD的流行病学分析NAFLD是临床上最常见的肝脏代谢紊乱性疾病，其发病率为20%～30%，在2型糖尿病的发病率中则高达70%～80%[7]，其中造成NAFLD病理特征最主要的原因是三酰甘油在肝脏内的堆积。其发病范畴从既往的脂肪性转化为非酒精性脂肪性肝炎(NAFLD)，现阶段认为造成NAFLD的主要因素为胰岛素抵抗，游离脂肪酸会增加糖类与脂肪代谢紊乱的几率[8]，造成肝脏细胞发生炎性反应以及损伤。目前NAFLD在我国的发病率直线上升，其中糖尿病患者比同龄人发生脂肪肝的几率高出80%[9]，临床治疗的主要手段在于阻止疾病的恶化，同时对引发代谢性综合征的各种危险因素进行预防，包括血脂紊乱、胰岛素抵抗等。其中血脂紊乱、胰岛素抵抗与肥胖都与能量的消耗及食物的摄入有密切的关系，且NAFLD被作为2型糖尿病的危险独立因素[10]。NAFLD患者的脂质在肝脏内发生沉积，其重量超过自身肝脏的5%[11]，经显微镜下观察发现图形特征主要是弥漫性肝细胞大泡性脂肪病变，病理类型除了单纯性的脂肪肝外，还包括脂肪性肝炎与肝硬化，严重者甚至出现恶性肿瘤。NAFLD患者通过肝脏穿刺后行病理活检即可确诊，其影像学检查也是临床常用的诊断辅助方式之一，但对于单纯性的脂肪肝和脂肪性肝炎并不能进行良好的区别。NAFLD的发病机制尚未完全明确，现阶段临床较为认可的为“二次打击”学说[12]，第一次打击为以胰岛素抵抗为主因造成的三酰甘油在肝脏内进行沉积；第二次打击为以氧化应激为主因造成的纤维化病变与炎性病变。国外学者Varricchio等[13]研究发现，胰岛素抵抗会随着肝脏内脂肪的增加而增加，而酒精性脂肪肝与T2DM的治疗仍然处于不断的探索与研究中，现阶段对于酒精性脂肪肝与T2DM患者的治疗主要是通过对其生活方式的干预来控制病情，包括饮食、运动等。NAFLD患者通常伴有T2DM、肥胖与脂质紊乱，同时糖尿病、胰岛素抵抗也参与了NAFLD的发生及发展，由于脂肪肝还会刺激胰岛素的分泌，由此胰岛素抵抗也会随之明显，所以形成了恶性循环[10]。

3.2Nesfatin- 1的生理作用Nesfatin- 1是日本学者在2006年时初次发现的一种在下丘脑的神经肽，可对摄食进行调控。有研究发现[14]，Nesfatin- 1是核组蛋白的前身，由于大鼠、小鼠及人的氨基酸序列的同源性较高，所以研究采用大鼠进行了核组蛋白注入，结果发现大鼠在注入核组蛋白后体重出现减少，同时摄食的剂量依赖性也随之降低；采用激素元转换酶对核组蛋白进行裂解，可得到三个片段，分别为Nesfatin- 1，Nesfatin- 2和Nesfatin- 3，将这三种片段分别注入大鼠的侧脑室，结果发现，Nesfatin- 1组大鼠出现剂量依赖性抑食作用，且相比另外两组大鼠差异有统计学意义(P<0.05)。随后将Nesfatin- 1的特异性抗体再次注入大鼠的脑室，结果发现大鼠的摄食出现增加，学者推断Nesfatin- 1属于一种饱食分子，具有降低体重、抑制摄食的作用。另外有研究发现[14]，Nesfatin- 1不仅存在于下丘脑，其中心脏、胰岛、胃黏膜、脂肪等多种外周组织中均存在Nesfatin- 1，进一步说明了Nesfatin- 1对于食物的摄入具有控制作用，同时还能调节能量的代谢、改善胰岛素抵抗以及调节糖类与脂肪的代谢，所以Nesfatin- 1在糖尿病与脂类代谢紊乱疾病中具有重要的作用。目前对于Nesfatin- 1的作用机制尚未完全明确，但多数研究都证实了以上的观点。大多数学者发现血清Nesfatin- 1水平与BMI，血糖、胰岛素抵抗及NAFLD等有明显关系。国外学者Basar等[15]对糖耐量正常的NAFLD及非NAFLD患者血清Nesfatin- 1浓度进行了研究，结果发现NAFLD患者血清Nesfatin- 1浓度相比健康人群含量明显减少(P<0.05)，同时NAFLD组中存在胰岛素抵抗患者显著低于胰岛素敏感的患者，所以推断Nesfatin- 1或与NAFLD的发病相关。本次研究结果也发现，T2DM患者的血清Nesfatin- 1水平显著高于健康对照组，且低于T2DM- NAFLD组；并且T2DM患者的血清Nesfatin- 1水平与其病程有中度相关；而患者发生脂肪肝的几率与其BMI，TG和血清Nesfatin- 1水平也存在明显的关系。这一结论也与大多数学者的研究观点相一致。

随着目前对血清Nesfatin- 1研究的深入，国内外Nesfatin- 1的研究也有一定的争议，由于在NAFLD患者中研究其Nesfatin- 1水平的相对较少，所以对于T2DM并发NAFLD的血清Nesfatin- 1水平尚未见报道。本次研究发现，血清Nesfatin- 1可能参与T2DM与NAFLD的发生，旨在探究T2DM患者、NAFLD患者的血清Nesfatin- 1水平，同时研究Nesfatin- 1水平与患者发生胰岛素抵抗的关系。由于本次研究的样本含量较小，研究结果有一定的局限性，希望通过今后更为严谨的分析，对T2DM患者及NAFLD患者的发病机制进行深入的研究。

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