宫颈癌患者血浆miRNA- 10b的表达及其临床意义*

2018-04-12 03:10常春红管晓卿汪新宇郭甜静
现代检验医学杂志 2018年1期
关键词:标志物宫颈癌血浆

冯 磊,常春红,管晓卿,汪新宇,郭甜静 

(涿州市医院妇产科,河北涿州 072750)

宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤,其发病率有逐年上升和年轻化发展的趋势,已成为严重威胁女性生命健康的恶性肿瘤之一[1]。宫颈上皮内瘤样病变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)是宫颈癌的癌前病变,早期诊断和治疗CIN对于预防宫颈癌有着重要的意义。近年研究表明,微小核糖核酸(microRNA,miRNA)在肿瘤发生、发展及转移中起着重要的作用,其中miRNA- 10b与多种恶性肿瘤的发生有关,可能在肿瘤发生过程中发挥癌基因的作用[2,3]。本研究通过检测血浆miRNA- 10b在宫颈癌患者中的表达情况,分析其表达与宫颈癌临床病理特征间的关系,旨在为宫颈癌的早期诊断及靶向治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1研究对象选取2014年3月~2017年3月河北省涿州市医院妇产科收治的宫颈癌患者168例,年龄29~76(47.36±10.85)岁。纳入标准:①符合国际妇产科联合会(FIGO)分类标准和WHO分级标准,且经病理确诊为宫颈癌者;②术前均未接受放射治疗、化疗及生物免疫治疗者;③能配合本次研究及病历资料完整者。宫颈癌临床分期:I期58例,Ⅱ期67例,Ⅲ期25例,Ⅳ期 18例;病理类型:鳞状细胞癌140例,腺癌28例;病理分级:G1 34例,G2 56例,G3 78例;有淋巴结转移45例,无淋巴结转移123例。另取同期与宫颈癌患者年龄匹配的CIN患者68例(CIN Ⅱ 21例,CIN Ⅲ 47例)作为CIN组和正常健康女性45例作为对照组。宫颈癌组、CIN组和对照组间年龄、体质指数、婚姻状况、吸烟史、饮酒史、家族史及流产史比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。所有研究对象均于清晨空腹抽静脉血5 ml,离心分离血浆后保存于-80℃冰箱待检。

1.2方法

1.2.1主要试剂和仪器:RNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司,在ABI 7500型荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量聚合酶链反应(RT- PCR)。

1.2.2miRNA的提取:取300 μl血浆样本,加入1 ml总miRNA提取液,按照血液总miRNA快速提取试剂盒(miRNeasy血浆提取试剂盒)说明书从血浆中提取总RNA。

1.2.3miRNA逆转录及RT- PCR检测:以U6为实验内参,miRNA逆转录反应体系:5 μl RNA模板,3 μl U6及miRNA特异性茎环引物,0.15 μl 100 mmol/L dNTPs(with dTTP),1.00 μl逆转录酶(50 U/μl),1.50 μl 10×反转录缓冲液,0.19 μl RNase抑制剂(20 U/μl),4.16 μl无菌三蒸水。反应条件:16℃30 min,42℃30 min,85℃5 min,4℃保存,进行逆转录反应。以U6为实验内参,反应体系为20 μl:1.00 μl TaqMan Small RNA Assay(20×)溶液,10.00 μl TaqMan⑧Universal PCR Master MixⅡ(2×)溶液,1.33 μl反转录产物cDNA,7.67 μl DEPC水。扩增条件为:95℃10 min 1个循环,95℃15 s,60℃60 s进行40个循环,实验重复3次。每个反应体系中荧光信号达到所设定阈值的经历的循环数即为Ct值,以U6为内参照,采用2- △△Ct法计算miRNA- 10b的相对表达水平,其中△Ct=Ct目的基因-CtU6。

1.2.4血浆鳞状细胞癌抗原(SCCA)和癌胚抗原(CEA)检测:分别采用贝克曼和罗氏电化学发光免疫分析仪及配套试剂盒,化学发光法测定SCCA和CEA水平,操作过程严格按照说明书进行。

2 结果

2.1各组血浆miRNA- 10b,SCCA及CEA表达水平比较见表1。宫颈癌组血浆miRNA- 10b,SCCA及CEA表达水平均明显高于CIN组和对照组,差异有统计学意义(F=17.842,13.614,8.273,均P<0.01);而CIN组与对照组血浆miRNA- 10b,SCCA及CEA表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组血浆miRNA- 10b,SCCA及CEA表达水平比较

2.2宫颈癌患者血浆miRNA- 10b表达与临床病理特征的关系见表2。随着宫颈癌临床分期的进展,miRNA- 10b表达水平逐渐升高,Ⅲ~Ⅳ期宫颈癌患者中miRNA- 10b表达水平明显高于Ⅰ~Ⅱ期,差异有统计学意义(t/F值=19.287,P<0.01)。血浆miRNA- 10b表达水平与淋巴结转移、浸润深度及SCCA水平也相关(t/F值=21.528,5.672,5.284,均P<0.05),而与年龄、病理类型、病理分级、肿瘤大小、绝经状态及CEA水平差异无统计学意义(t/F值=0.462,0.714,0.487,0.828,0.318,0.663,均P>0.05)。

表2宫颈癌患者血浆miRNA- 10b表达与临床病理特征的关系

  组 别nnmiRNA⁃10b(2⁃△△Ct)t/F值P值年龄(岁) <45     ≥45临床分期 Ⅰ~Ⅱ期     Ⅲ~Ⅳ期798912543572±193594±177341±124827±3150462 192870513 <0001病理类型 鳞癌     腺癌14028604±185568±16207140426病理分级 G1     G2     G3345678595±182573±168586±17504870509肿瘤大小 ≤4cm     >4cm9771571±165603±19408280314淋巴结转移 是      否45123338±126841±31721528<0001绝经 是   否56112580±176587±18203180627浸润深度 ≤1/2肌层     >1/2肌层65103415±134806±32656720012SCCA(ng/ml) <60       ≥607890426±137793±30852840018CEA(ng/ml) <50       ≥5010761576±173592±18506630482

2.3血浆miRNA- 10b,SCCA及CEA对宫颈癌的诊断价值见表3。血浆miRNA- 10b,SCCA,CEA及三项联合诊断宫颈癌的曲线下面积(AUC)及95%CI分别为0.836(0.752~0.924),0.795(0.722~0.875),0.664(0.596~0.738),0.882(0.794~0.958),与对照组(AUC=0.5)比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。miRNA- 10b,SCCA及CEA诊断宫颈癌的最佳截值分别为4.26,6.58 ng/ml,4.05 ng/ml。三项联合诊断宫颈癌的敏感度和特异度较好,分别为84.7%和81.4%。

2.4多元Logistic回归分析血浆miRNA- 10b,SCCA,CEA与宫颈癌的关系见表4。把宫颈癌组与对照组作为二分变量,以miRNA- 10b,SCCA及CEA作为自变量,应用多元logistic回归模型对两组数据进行分析。结果显示,血浆miRNA- 10b和SCCA水平升高是宫颈癌发生的独立危险因素[OR(95%CI)=1.816(1.629~2.483),OR(95%CI)=1.427(1.206~1.975)]。

表3 血浆miRNA- 10b,SCCA及CEA对宫颈癌的诊断价值

表4 多元Logistic回归分析血浆miRNA- 10b,SCCA,CEA与宫颈癌的关系

2.5宫颈癌患者血浆miRNA- 10b与SCCA,CEA的相关性见图1。

图1 血浆miRNA- 10b与SCCA,CEA的相关性

Pearson相关分析显示,血浆miRNA- 10b与SCCA呈正相关(r=0.637,P<0.01);血浆miRNA- 10b与CEA无明显相关(r=0.108,P>0.05)。

3 讨论

宫颈癌的发生是多基因、多因素和多阶段共同作用的过程,其病理机制目前尚不完全明确。微小核糖核酸(miRNA)是一类内源性非编码的小RNA,在肿瘤生理病理过程中发挥着重要的调控作用,有望成为一种新的疾病诊断、分类和预后判断的工具[4]。已有研究证实,多种miRNA在宫颈癌中异常表达,与宫颈癌的发生、发展、转移及预后密切相关,可作为宫颈癌早期诊断和预后判断的新型标记物[5]。近年来研究发现,血浆miRNA- 10b在多种恶性肿瘤中异常表达,且不同组织来源的恶性肿瘤中表达水平存在明显差异,是诊断恶性肿瘤患者的潜在生物学指标[6,7]。然而,血浆miRNA- 10b能否作为宫颈癌早期诊断的分子标志物,目前尚未明确。

本研究结果显示,宫颈癌组血浆miRNA- 10b,SCCA及CEA表达水平均明显高于CIN组和对照组,而CIN组与对照组无显著差异。在宫颈癌患者临床病理分期中,Ⅲ~Ⅳ期患者血浆miRNA- 10b的表达水平明显高于Ⅰ~Ⅱ期。说明血浆miRNA- 10b在宫颈癌患者中异常表达,可能通过发挥癌基因的作用来调节宫颈癌的发生发展过程。Hou等[8]研究认为,miRNA- 10b作为miRNA家族中的一员,在宫颈癌患者中存在异常表达,并且与肿瘤的侵袭及远处转移有密切关系。另有研究表明,异常表达的miRNA参与了宫颈癌的发病和进展,可以将miRNA作为宫颈癌新的诊断标志物和生物治疗新的靶点[9]。此外,进一步分析miRNA- 10b表达与宫颈癌临床病理特征的关系,显示miRNA- 10b表达水平与淋巴结转移及浸润深度有关,提示miRNA- 10b在肿瘤预测方面有一定的作用,分析其原因可能是存在淋巴结转移的患者肿瘤负荷往往较大,肿瘤组织可释放更多的具有原癌基因作用的miRNA进入血液,同时可抑制机体原有的具有抑癌作用的miRNA水平表达,进而导致机体miRNA表达水平异常升高;浸润越深的患者病情进展越快,肿瘤组织miRNA表达水平升高越明显。Zou等[10]研究也显示,miRNA- 10b在宫颈癌患者的发生发展过程中具有一定的作用,可能促进宫颈癌患者的进展和转移。

应用ROC曲线分析,结果显示血浆miRNA- 10b对宫颈癌患者的诊断效能明显优于传统肿瘤标志物SCCA和CEA,其最佳截值为4.26,敏感度和特异度分别为82.6%和80.2%;三项联合诊断宫颈癌的敏感度和特异度最好,分别为84.7%和81.4%。相关性分析显示,血浆miRNA- 10b与SCCA呈正相关。说明血浆miRNA- 10b可作为宫颈癌辅助诊断的新型肿瘤标志物,三项联合检测有助于提高宫颈癌早期诊断的准确性。既往研究表明,血浆miRNA- 10b在肿瘤患者中表达升高,是肿瘤预后监测的独立指标,有可能成为肿瘤早期诊断的生物标志物[11]。Parrella等[12]研究也表明,血浆miRNA- 10b在肿瘤预后方面具有一定的临床应用价值,可作为肿瘤治疗的新靶点。本研究中,血浆miRNA- 10b和SCCA水平升高是宫颈癌发生的独立危险因素,而与年龄、病理类型、病理分级、肿瘤大小、绝经状态及CEA水平无关。提示miRNA- 10b可独立作为宫颈癌早期诊断的分子标志物。Saldanha等[13]研究认为,miRNA- 10b在肿瘤患者中异常表达,能成为临床实践中一项新的诊断和预后标志物。Eissa等[14]研究也发现,肿瘤组织中miRNA- 10b的表达变化有助于调控细胞周期调节通路,而细胞通路的激活又抑制其他靶基因,故miRNA的表达模式可作为肿瘤的潜在标志物。另有研究表明,循环miRNA- 10b是检测乳腺癌淋巴结转移的潜在生物标志物[15]。

综上所述,血浆miRNA- 10b在宫颈癌患者中异常表达,有望作为早期诊断宫颈癌的分子标志物,与SCCA和CEA联合应用可提高宫颈癌诊断的准确性。但本研究为单中心的临床研究,其结果可能存在一定的偏差,尚需多中心、大样本的前瞻性研究来进一步验证。

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