人血清幽门螺杆菌SodB抗体检测与胃癌发生的相关性研究*

田文静，刘电力，刘惠敏，范　清，谢文珍，东英子　

(1.哈尔滨医科大学公共卫生学院，哈尔滨　150081；2.哈尔滨医科大学第四附属医院神经内科，哈尔滨　150001；3.哈尔滨市香坊区疾病预防控制中心，哈尔滨　150046)

世界卫生组织在2012年公布的调查报告中显示，胃癌是一种多发于东亚地区的常见恶性肿瘤[1]。在中国，虽然胃癌发病率和死亡率近年来均呈下降趋势[2]，但在2017年发布的中国恶性肿瘤报告中显示，2013年我国胃癌发病率在255种登记癌症中居第二位，是男性第二及女性第四常见的恶性肿瘤，是男性第三位及女性第二位癌症死亡原因。且在低、中、高度城市化地区胃癌的发病率和死亡率均较高[3]。由于其预后较差，因此选取一种简便、无痛苦、尽可能准确的方式进行早期筛查，是十分必要的。

由H.pylori基因组编码产生的铁辅因子超氧化物歧化酶(iron- cofactored superoxide dismutase，SodB)在幽门螺杆菌定植宿主胃黏膜的过程中起到重要作用，是影响幽门螺杆菌定植宿主胃部能力的毒力因子，利于氧化应激条件下幽门螺杆菌的生长和存活[4]。在本研究中，我们通过对幽门螺杆菌SodB血清抗体水平和是否患胃癌之间的关系进行分析，来评价SodB作为胃癌血清学筛查的生物标志物的价值。

1　材料与方法

1.1研究对象2010年3～7月间从黑龙江省肿瘤医院住院处获得经临床诊断确诊的胃癌病例114例。对照包括2011年3～5月间来自哈尔滨市香坊区疾病预防控制中心的54例健康体检人群以及来自哈尔滨医科大学第四附属医院神经内科的50例非胃癌患者。所有研究对象经知情同意后采集外周静脉血5 ml。

对研究对象采用问卷进行调查，调查问卷内容包括：一般人口学指标、疾病相关的主要暴露因素、胃癌患者的临床相关资料。

1.2试剂和仪器Broadford蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物公司。山羊血清封闭液购自武汉Boster生物公司。辣根酶标记山羊抗人IgG购自北京中杉金桥生物公司。TMB购自北京天根生化公司。其他试剂均为国产分析纯。重组质粒sodB- pET32a及其诱导表达的目的蛋白为本实验室制作并保存。

1.3方法将SodB纯化蛋白浓度稀释至2，0.5，0.25 μg/ml，每孔100 μl加至96孔板，4℃过夜。洗板3次，每次3 min，每孔加入200 μl封闭液(1 mg/dl BSA)，37℃水浴2 h。用血清稀释液(0.1 ml/dl BSA+PBS)将目标血清按照400，1 600，3 200，3 600倍稀释，空白孔为0.1 ml/dl BSA和PBS，每孔100 μl，37℃水浴1 h。每孔加入100 μl用PBS稀释的辣根酶标记羊抗人IgG(1∶5 000稀释)，37℃水浴30 min。每孔加入100 μl显色液(TMB)，37℃避光水浴15 min。加入等体积1 mol/L硫酸溶液终止反应，450 nm下读取吸光度A值。

1.4统计学分析采用t检验和χ2检验来比较病例组和对照组之间的定量变量和定性变量分布差异情况。SodB抗体的A值≤最佳临界值则被定义为阳性，反之则定义为阴性。应用条件logistic回归方法计算比值比(ORs)及其95%置信区间(95% CIs)来分析SodB抗体与胃癌之间的关系。通过计算ROC曲线下面积(area under the ROC curves， AUCs)来分析、评价SodB抗体在胃癌筛查中的价值。以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1研究对象的基本情况本研究采用病例对照研究的方法，通过年龄、性别进行1∶1配对，共纳入胃癌病例和对照各114例。

病例组和对照组年龄分别为53.86±8.15岁和53.05±7.65岁，病例组与对照组间年龄分布均衡，差异无统计学意义(t=0.771，P=0.441)。病例组和对照组各包括男性82人(71.9%)，女性32人(28.1%)。受教育程度和BMI体重指数在病例组及对照组间差异有统计学意义(χ2=9.185，P=0.027；χ2=16.121，P=0.003)。病例组和对照组吸烟人数分别为66人(57.89%)和54人(47.37%)，经检验两组吸烟情况存在统计学差异(χ2=9.376，P=0.009)。两组饮酒情况差异也具有统计学意义(χ2=9.783，P=0.008)。病例组中具有胃癌家族史人数为11人(9.65%)，而对照组中均无胃癌家族史，经检验两组间差异具有统计学意义(χ2=23.892，P<0.001)。另外，两组间H.pylori感染情况差异无统计学意义(χ2=1.559，P=0.459)。综上，受教育程度、BMI体重指数、吸烟情况、饮酒情况及胃癌家族史应作为多因素分析时的调整因素。

根据收集的临床资料按照TNM分期标准对胃癌患者进行临床分期，其中7.84%(8/102)为Ⅰ期，10.78%(11/102)为Ⅱ期，73.53%(75/102)为Ⅲ期，7.84%(8/102)为Ⅳ期，缺失数据为12例。

2.2人血清SodB抗体与胃癌发病风险的关系见表1。在本研究人群中，选取SodB抗体A值0.028(最佳临界值)作为筛查胃癌的临界值，发现在病例和对照中H.pyloriSodB抗体阳性率分别为52.6%和36.8%。logistic回归结果显示，SodB抗体与胃癌发病风险关联的A值(95%CI)为2.287(1.191～4.391)。

表1人血清SodB抗体水平与胃癌发病风险之间的关系[n(%)]

SodB感染情况病例数对照数OR(95%CI)∗P阴性阳性54(474)60(526)72(632)42(368)102287(1191～4391)0013

注：*通过调整年龄、性别、BMI体重指数、教育、吸烟、饮酒、肿瘤家族史后，应用多因素logistic回归分析获得。

2.3人血清SodB抗体ROC曲线下面积见图1。

图1　SodB抗体滴度测定ROC曲线

3　讨论

幽门螺杆菌是已经被证实的上消化道疾病最重要的危险因素之一。流行病学调查显示其感染可使胃癌发生风险大幅度增加。研究显示，根除H.pylori可使胃癌发病风险减少。但因世界范围内有数目庞大的感染人群，使得根除全部感染人群体内的H.pylori无法实现。因此，迫切需要寻找用于筛查胃癌的可靠生物标志物。

大多数H.pylori感染者并无临床表现，癌症发生并确诊时往往已经到达癌症的中晚期，因此预防胃癌发生及改善其预后需要提早发现和诊断的时间。研究显示只有少数H.pylori感染者罹患胃癌[5]，说明个体对H.pylori毒力的免疫能力是不同的。目前研究多集中于H.pylori的几个明星毒力因子，如CagA(细胞毒素相关基因蛋白)和VacA(空泡毒素)，对其他潜在毒力因子的研究较少。在本研究中，使用H.pylori毒力因子SodB作为免疫抗原，利用病例对照研究的方法研究其血清抗体与胃癌发生的关系，探讨H.pyloriSodB能否作为有效的新胃癌筛查生物标志物。

本实验室使用SodB蛋白作为免疫抗原进行酶联免疫吸附测定，结果显示，在本研究人群，血清SodB抗体阳性可使胃癌发生风险显著升高，但二者间并不存在剂量反应关系(数据未列出)。使用ROC曲线验证SodB能否作为胃癌筛查的标志物，结果发现在本研究人群中，AUC为0.575(95%CI：0.501～0.649)。一般来说，AUC在0.5～0.7被认为是准确度较低，0.7 ～ 0.9为较好，高于0.9为高准确度[6]。说明虽然SodB抗体阳性率与胃癌发生有关，但独立作为胃癌血清学筛查生物标志物的价值不高。近年有学者开始研究胃癌相关血清生物标志物的联合检测的作用，有学者发现了PGI，PGI/PGII，TSGF，TK1和CEA的联合检测分析可能更有助于对胃癌的诊断[7]。所以在接下来的研究中，可以考虑与其他血清生物标志物联合，以提高诊断水平。

综上所述，本研究发现H.pyloriSodB血清抗体水平与胃癌发生有关，但其不宜独立作为胃癌血清学筛查的生物标志物。

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