金匮肾气丸对庆大霉素致聋豚鼠耳蜗GABAA受体表达的影响

蒋浩贤 卢宇涵 朱香茹 张梦茜 赵乌兰# 丁丽凤#

庆大霉素是最常见的氨基糖苷类抗生素，因具有耳毒性等毒副作用[1]，限制了其临床使用。庆大霉素可对内耳造成结构损坏导致听力损失、平衡障碍和耳鸣[2]。有学者认为庆大霉素可激活体内的氨基酸激酶，导致毛细胞凋亡，通过抑制氨基酸激酶的活化可减轻庆大霉素对毛细胞的损害[3]。

有研究表明耳蜗损毁后螺旋神经节元GABA表达及其神经元数量也呈明显下降[4]，GABA是听觉外周感受器耳蜗中重要的抑制性神经递质，而GABAA受体是门控性离子通道型的一种，通过结合GABA介导神经元抑制。GABAA受体主要有α、β和γ三种亚型，其中GABAARα1是表达量最高的亚型之一[5]，是GABAAR的重要功能基团，其表达的下调与听觉功能下降有密切的联系[6]。

中医有“肾主耳，在窍为耳”（《素问阴阳应象大论》）的论证依据，并有采用中医药补肾助阳药方，以缓解耳聋[7]。考虑其有效成分和具体作用机制不明，本研究旨在通过观察造模后庆大霉素对豚鼠听力的损伤程度和中药制剂金匮肾气丸对该损伤的保护程度，采用免疫印迹法测定耳蜗内GABAARα1在药物损伤下和保护下的表达，探讨补肾方对庆大霉素致耳蜗损伤的保护作用。

1　材料与方法

1.1　研究对象与分组

选取30只（60耳）体重330.0±20.0 g，双侧耳廓反射正常，无耳疾，体态、毛色、活动度正常的普通级DHP白毛红目雌性豚鼠并随机平均分成3组：正常对照组（CG组）采用2.5 ml.kg-1.d-1生理盐水注射；模型组（GM组）采用硫酸庆大霉素注射液100 mg.kg-1.d-1；治疗组（TG组）采用硫酸庆大霉素注射液100 mg.kg-1.d-1+补肾方灌胃13.5 g.kg-1.d-1。连续造模12天。

本研究所有实验均在浙江中医药大学动物实验中心进行，实验动物由该中心提供及常规饲养，实验操作均由该中心协助，不涉及动物伦理、福利等问题。

1.2　补肾方与试剂

补肾方：即金匮肾气丸复方，摘自《金匮要略》拟方：熟地黄30 g、山药20 g、山茱萸15 g、牡丹皮10 g、茯苓10 g、泽泻10 g、桂枝5 g、制附子5 g，生药含量1 g/ml。硫酸庆大霉素注射液：8万单位／2 ml/每支，购自辰欣药业股份有限公司（批号1608102231）；戊巴比妥钠由浙江中医药大学动物实验中心提供；GABA receptor alpha 1兔多克隆抗体购自Abcam公司（货号：ab33299）。

1.3　方法

1.3.1DPOAE测试 采用美国智听Smart OAE耳声发射仪器，所有测试均在隔声室进行。豚鼠麻醉，保持自主呼吸，维持动物体温，将探头轻柔地放置外耳道。f2/f1=1.22，L1=65 dB SPL，L2=55 dB SPL，并对不同组别在2、3、4、6和8 kHz处的DPOAE振幅进行统计学分析。

1.3.2ABR阈值测试 采用美国GSI Audera听觉诱发电位仪，豚鼠行1%戊巴比妥钠30 mg.kg-1腹腔注射麻醉后，俯卧于保温毯上。两耳廓前沿连线中点颅顶为记录电极入针点，参考电极插入外耳廓后软组织内，地极插入鼻尖处，在标准屏蔽隔声室内用短声（click）刺激，刺激速率11.1 次/秒，开窗时程20 ms，带通滤波为100～3000 Hz，信号叠加512次。起始声刺激为90 dB nHL引出后逐步降低强度10 dB直至无法引出可以重复的ABR波形，重复后仍未引出后以强度5 dB提高刺激强度，以引出波Ⅱ或波Ⅲ的最小刺激强度记为ABR阈值。ABR测试行毕后立即断头取耳蜗。

1.3.3免疫印记检测 采用总蛋白提取试剂盒（含protease inhibitor cocktail）进行总蛋白的提取，采用BCA定量试剂盒进行总蛋白定量。配胶后每个孔60 ug总蛋白进行上样，每孔10～15 ul，电泳2 h左右。聚偏二氟乙烯（polyvinylidene flouride，PVDF）膜甲醇中浸泡20 s，然后转移到Tris-Glycine转移缓冲液（含5%甲醇）中平衡5 min；SDS-PAGE凝胶在Tris-Glycine转移缓冲液平衡30 min；在冷却全湿转膜2 h。转膜结束后，放到T-TBS(5%脱脂奶粉)，室温封闭1 h，然后T-TBS漂洗5 min×3。一抗以一定比例溶于T-TBS（含3%脱脂奶粉），4℃孵育过夜；然后T-TBS漂洗5 min×4。二抗以一定比例溶于T-TBS（含2%脱脂奶粉），室温1 h；然后T-TBS漂洗5 min×5。采用SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate制备约1 ml ECL工作液，室温孵育转印膜1 min，去除多余ECL试剂，保鲜膜密封，暗盒中放上X-ray film曝光5～10 min后进行显影和定影。采用Image J软件分析条带的光密度值，每个条带重复3次，目的蛋白相对表达量=[目的蛋白（光密度值）/内参（光密度值）]×10 n。

1.4　统计方法

实验数据采用SPSS 23.0软件统计分析，计数统计采用平均数±标准差（±s）表示。独立样本t检验用于检验不同组别间ABR阈值和DPOAE振幅的差异。以P＜0.05表示组间差异具有显著统计学意义，以P＜0.01表示组间差异具有极显著统计学意义。

2　结果

2.1　ABR阈值的比较

本研究豚鼠造模后，模型组（GM）和治疗组（TG组）的ABR阈值均较正常对照组（CG组）升高，并具有极显著统计学差异（P＜0.01）；TG组的ABR阈值显著低于GM组（P＜0.05），见表1。

表1　各组豚鼠ABR阈值比较（±s ）

表1　各组豚鼠ABR阈值比较（±s ）

组

2.2　DPOAE幅值的比较

本研究豚鼠造模后，GM组和TG组的DPOAE幅值在不同频率（2、3、4、6、8 kHz）均较CG组低（见表2），且GM组与CG组的DPOAE幅值在各频率点均具有极显著统计学差异（P＜0.01）；而TG组和GM组的DPOAE振幅在4 k和8 kHz处具有显著统计学差异（P＜0.05），见图1。

表2　各组豚鼠DPOAE幅值比较（±s ）

表2　各组豚鼠DPOAE幅值比较（±s ）

组别 　耳数（n）　　　 DPOAE振幅（dB SPL）2 kHz　3 kHz　4 kHz　 6 kHz　 8 kHz CG 　14 　9.9±3.2 15.4±8.7 12.6±4.9 　13.4±9.0 　32.6±11.0 GM 　12 -5.1±2.9 -3.7±9.3 -12.4±4.6 -1.1±5.0 -13.6±5.2 TG 　11 -1.3±2.1 3.8±2.2 -2.5±5.1 2.0±1.4　 3.8±2.6

图1　各组豚鼠DPOAE在不同频率处的振幅比较

2.3　耳蜗GABAARα1相对表达量的比较

采用Western blot分析各组豚鼠耳蜗GABAARα1蛋白表达量并行组间比较。GM组的GABAARα1蛋白表达量较CG组低并具有极显著统计学差异（P＜0.01)；TG组的GABAARα1蛋白表达量较GM组高并具有显著统计学差异（P＜0.05)，但较CG组低（P＞0.05），见图2。

图2　GABAARα1在各组耳蜗螺旋神经节中表达值

3　讨论

庆大霉素是最常见的氨基糖苷类抗生素，可进入内耳淋巴液，通过在内耳外淋巴液中蓄积并通过干扰内耳Corti器内外毛细胞的糖代谢和能量利用，导致内耳毛细胞膜上钠、钾离子泵功能障碍和耳蜗的毛细胞广泛损伤，表现为药物中毒性听力损失[8]。庆大霉素还具有肾毒性，并且肾毒性早于耳毒性[9]。目前，药物中毒性听力损失仍以预防为主，虽然耳聋基因筛查对敏感性个体的耳毒性药物应用有重要指导意义[10，11]，但临床诊疗中因应用氨基糖苷类抗生素致聋的病例时有发生[12]。临床中对耳毒性药物导致的感音神经性听力损失，现有的治疗手段却很有限[15]，而中医药的补肾方在听力保护和治疗中已有应用，并取得一定成效[7，14，15]。

现代中医研究[7，14～16]认为，庆大霉素造成的药物性聋属肾虚耳聋范畴，金匮肾气丸源自中医经典书籍，医圣张仲景所著《金匮要略》，为中医传统的补肾方药。金贵肾气丸通过组方配伍达到温补肾阳化气行水的功效，纠正庆大霉素的肾毒性，以拮抗庆大霉素的损伤[16]。

本研究中，GM组豚鼠ABR阈值升高，且DPOAE各个频率点均未引出。TG豚鼠在ABR测试中其听力阈值与GM组，组间存在显著统计学差异（P＜0.05)，但仍差于正常对照组。说明金贵肾气丸治疗组确有一定的拮抗庆大霉素毒性作用与前期研究一致[16]。

GABA作为耳蜗听觉传导通路中重要的神经递质，与多项听觉功能相关[5，6]。有研究证实耳蜗核GABA含量降低可能与耳聋的发病具有一定的相关性[4，17]。本实验中TG组豚鼠耳蜗GABAARα1表达尽管低于正常对照组（P＞0.05），但显著高于GM组（P＜0.05）。庆大霉素造模后，其表达下降提示听觉功能的下降；而在金匮肾气丸汤剂的拮抗下，上调蛋白的表达以此保护了听觉功能，该结果与ABR反应阈值结果一致。

综上所述，本研究对庆大霉素致药物性听力损失的临床治疗有一定参考价值，但仍有不足之处。比如采用click声刺激的ABR无法准确的描述庆大霉素对豚鼠在各频率段尤其是高频的损伤，无法与DPOAE结果做相互验证；同时未在实验前测试豚鼠听觉功能，导致实验前后的阈移结果无法得到。此外金匮肾气丸汤剂对庆大霉素引起的听力损失的保护作用机制仍需进一步研究。

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