微波辅助紫荆籽中蛋白质的提取工艺研究

董翠芳，孙栗缘

(沧州师范学院 化学与化工学院，河北 沧州 061001)

植物籽粕作为植物制油过程中的副产物，含有多种具有较高利用价值的成分，如碳水化合物、纤维素、粗脂肪以及矿物质等[1]，其中蛋白质是含量较高的重要成分[2].与动物蛋白相比，植物蛋白日常用量较大，提取原料具有普遍性，且在加工生产中，成本低廉、工艺相对简单[3].紫荆是豆科紫荆属植物[4]，其荚果产量丰富，常被丢弃，十分可惜.开发和利用紫荆籽中的植物蛋白，对实现紫荆籽的废弃物再利用具有一定的意义.

目前，提取植物蛋白质较成熟的方法有：水相酶解法、有机溶剂法、超声波辅助技术、水相萃取法等.其中水相萃取法由于其工艺简单、成本低，易于工业化生产，相比较于有机溶剂法，对环境污染程度低等优点而常被使用[5].常用的水相有：NaOH溶液、水、稀酸、NaCl溶液及六偏磷酸钠溶液等.本研究以沧州师范学院校园景观树紫荆的籽为原材料，用石油醚浸提去除紫荆籽中的油脂得紫荆籽粕，采取微波辅助-水相萃取法进行紫荆籽蛋白的提取，利用单因素实验和正交实验对紫荆籽蛋白的提取工艺进行优化进而得到最佳提取工艺条件.同时讨论微波辅助提取技术在紫荆籽蛋白提取方面的优势及可行性，为紫荆籽蛋白的开发利用提供理论依据和实践指导.

1　实验部分

1.1　仪器与药品

仪器：XO-SM200超声波微波组合反应系统(南京先欧仪器制造有限公司)、金怡TDL-5低速台式大容量离心机(江苏省金坛医疗仪器厂)、721-分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)、SL-100型高速多功能粉碎机(浙江省永康市松青五金厂)、202-2型干燥箱(上海市实验仪器总厂).

原料预处理：紫荆籽(采自沧州师范学院)烘干粉碎，经石油醚脱脂后干燥粉碎过60目筛得紫荆籽粕.

药品：牛血清白蛋白(生化试剂)、考马斯亮蓝(G-250)、石油醚(沸程60-90℃)、95%乙醇、85%磷酸、氢氧化钠、36%-38%浓盐酸、氯化钠、硫酸铜、硫酸钾、硫酸、硼酸、甲基红指示剂、溴甲酚绿指示剂等(均为分析纯).

1.2　实验方法

1.2.1微波辅助水相萃取紫荆籽蛋白

称取一定质量的紫荆籽粕，按比例加入萃取剂置于微波辅助萃取仪中，设置一定的微波功率、提取时间和提取温度萃取紫荆籽蛋白；将液料转入离心管内，在转速3000r/min下离心15min，得到紫荆籽蛋白提取液.

1.2.2提取液中蛋白质含量的测定

采用考马斯亮蓝法[6]测定上清液中的蛋白质含量，计算紫荆籽蛋白提取率.

配制考马斯亮蓝G-250溶液：称取考马斯亮蓝G-250晶体100mg，加入95%的乙醇50mL，再加入85%的磷酸100mL，充分溶解，转移至1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容，过滤置于棕色试剂瓶中，保存于4℃冰箱中备用.

配制标准蛋白溶液：称取标准结晶牛血清白蛋白晶体100mg，用蒸馏水定容至1000mL，混合均匀，配成质量浓度为0.10mg·mL-1的标准蛋白质溶液，保存于4℃冰箱中备用.

绘制标准曲线：吸取标准蛋白溶液0，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00mL于10mL容量瓶中，分别加入3.00mL考马斯亮蓝溶液，加水定容至10mL，摇匀.以第一份为空白对照于595nm波长处测定吸光度.绘制标准曲线，得标准曲线的回归方程为Y=45.043X+0.0003，r=0.9961.其中Y为吸光度，X为牛血清白蛋白的浓度(mg·mL-1).

测定蛋白质含量：吸取1.00mL紫荆籽蛋白提取液，按上述步骤操作测定其吸光度，以标准曲线回归方程计算蛋白质质量.

紫荆籽粕中粗蛋白总质量=紫荆籽粕质量×23.5%(按照国家标准GB/T5511-2008进行测定).

2　结果与讨论

2.1　提取溶剂的选择

分别选择蒸馏水、稀碱(NaOH，0.1mol·L-1)、稀酸(HCl，0.1mol·L-1)、3.2%NaCl溶液作为提取溶剂进行实验，考察不同提取溶剂对紫荆籽蛋白质提取率的影响[7].采用微波辅助萃取，在微波功率100W、提取时间30min、液料比40∶1、提取温度35℃等相同的条件下进行提取.以紫荆籽蛋白提取率为标准，确定采用NaOH溶液为提取溶剂.实验结果如表1.

表1　不同提取溶剂对紫荆籽蛋白提取率的影响

2.2　单因素实验

2.2.1NaOH浓度对紫荆籽蛋白质提取率的影响

图1　NaOH浓度对蛋白质提取的影响

选取NaOH浓度(质量分数)分别为0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%，其他参数条件分别固定为：微波功率100W，提取时间30min，液料比40∶1，提取温度35℃，进行紫荆籽蛋白质的提取实验，结果见图1.

由图1可知，NaOH浓度对紫荆籽蛋白质提取率有显著的影响，呈现先上升后下降的趋势.当NaOH浓度达到1.5%时蛋白质提取率最大，继续增大碱浓度，会使部分蛋白质发生碱水解而降低提取率[8].因此，选取NaOH浓度为1.5%时最佳.

2.2.2微波功率对紫荆籽蛋白质提取率的影响

选取微波功率分别为80W、90W、100W、110W、120W，其他参数条件分别固定为：NaOH浓度1.5%，提取时间30min，液料比40∶1，提取温度35℃，进行紫荆籽蛋白质的提取实验，结果见图2.

由图2可知，随着微波功率的增大，蛋白质的提取效果增强，当功率达到100W时蛋白质提取率最高.当微波功率过高时，微波局部温度瞬时升高，导致部分蛋白质变性进而提取率下降[9].所以，以微波功率100W为最佳功率.

2.2.3提取时间对紫荆籽蛋白质提取率的影响

选择提取时间分别为10min、20min、30min、40min、50min，其他参数条件分别固定为：NaOH浓度1.5%，微波功率100W，液料比40∶1，提取温度35℃，进行紫荆籽蛋白质的提取实验，结果见图3.

由图3可知，提取时间小于30min时，由于提取时间过短，大量蛋白质没有溶解，故而蛋白提取率偏低.随着提取时间的延长，提取率不断增大.超过30min后由于微波热效应引起的热变性导致蛋白质溶解性质发生改变，从而导致提取率下降[10]，最终确定提取时间为30min.

图2　微波功率对蛋白质提取率的影响

图3　提取时间对蛋白质提取率的影响

2.2.4液料比对紫荆籽蛋白质提取率的影响

取液料比分别为20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1，其他参数条件分别固定为：NaOH浓度1.5%，微波功率100W，提取时间30min，提取温度35℃，进行紫荆籽蛋白质的提取实验，结果见图4.

由图4可知，在液料比为50∶1之前，由于液料比太小，蛋白质只能部分溶解，导致提取率偏低，但随着液料比的增加提取率有升高趋势，说明增加液料比有助于蛋白质的提取.当液料比增加到一定程度，紫荆籽蛋白基本全部溶解，再继续增加液料比没有意义[11]，因此确定液料比为50∶1.

2.2.5提取温度对紫荆籽蛋白质提取率的影响

选取提取温度分别为25℃、35℃、45℃、55℃、65℃，其他参数条件分别固定为：NaOH浓度1.5%，微波功率100W，提取时间30min，液料比50∶1，进行紫荆籽蛋白质的提取实验，结果见图5.

图4　液料比对蛋白质提取率的影响

图5　提取温度对蛋白质提取率的影响

由图5得知，在25-45℃的区间内，提取率随着温度的上升而增加，其原因可能是温度升高，分子剧烈运动，易析出蛋白.在45℃时，蛋白质全部溶解，提取率最高.超过45℃后，提取率呈平缓下降趋势.这可能是由于温度过高易使蛋白质聚集，降低溶解度，导致提取率下降[12].所以选取45℃为蛋白质提取的最适温度.

2.3　正交实验

选取NaOH浓度、微波功率、提取时间和提取温度四个因素，结合单因素实验的结果，设计四因素三水平(L934)的正交实验，以紫荆籽蛋白的提取率为标准，研究四个因素对提取率影响的主次关系，并对提取的工艺条件进行优化.具体的正交实验方案见表2，实验结果见表3.

表2　因素水平表

表3　正交实验方案与结果分析

对表3的正交实验结果进行直观分析[13]，由极差大小可知，影响紫荆籽蛋白提取率的各个因素的主次关系为：B>C>A>D.各因素的优选组合为A3B2C2D2，即优化后的最佳工艺条件为：NaOH浓度2.5%，微波功率100W，提取时间30min，提取温度45℃.

2.4　验证实验

在最佳工艺条件下进行3次平行实验，实验得蛋白质的平均提取率为90.4%.结果如表4，优化条件具有稳定性和实际可操作性[14].

表4　验证实验结果

2.5　提取方法的比较

分别采用微波辅助-水相萃取法和单独水相萃取法，在NaOH浓度2.5%，提取时间30min，液料比50∶1，提取温度45℃等相同的条件下进行蛋白质提取实验.实验结果如表5.

表5　不同提取方法对紫荆籽蛋白提取率的影响

由表5可知，微波辅助-水相萃取法对紫荆籽蛋白的提取效果好，提取率高，这可能是由于微波的破壁效应和热效应，使得籽粕蛋白能够更好的溶出[15].

3　结论

以脱脂紫荆籽粕为原材料，通过单因素实验和正交实验优化了微波辅助-水相萃取法提取紫荆籽蛋白的最佳工艺条件，即NaOH浓度2.5%，微波功率100W，提取时间30min，液料比50∶1，提取温度45℃.在此条件下紫荆籽蛋白的提取率为90.4%.其中微波功率对提取率的影响最大，提取时间和NaOH浓度次之，提取温度的影响最小.实验结果表明，将微波辅助技术应用于紫荆籽蛋白的提取，具有快速高效、条件温和、提取率高等特点.

参考文献：

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