牡丹峰地区东北林蛙肌肉重金属含量分析与评价

田新民 ，石兰英，乔征磊，刘长海，王 淼

东北林蛙（Rana dybowskii）隶属于蛙科林蛙属，主要分布于中国亚寒带的东北三省和内蒙古自治区，是重要药用价值林蛙油的主要来源，也具有较高的营养食用价值，为东北林区重要经济物种［1，2］。 近年来工农业活动，使土地和河水受到污染，特别是重金属的污染［3］，被蛙类等生物体吸收和富集，通过食物链进入人体，危害健康［4，5］。 因此有必要进行蛙类栖息环境、养殖条件及食用部位重金属评价领域的研究，而此领域主要集中在鱼类的研究［3，6］。

关于东北林蛙的研究，近些年在雌性林蛙油和营养价值等领域进行了深入研究，为林蛙保健食品的开发提供了重要的参考数据［7－10］，而对有害重金属含量的分析鲜有报道。牡丹峰国家级自然保护区距牡丹江市中心仅15 km，易受城市活动的影响。该区域内已开展多年的东北林蛙半人工养殖，同时建有林蛙储存库，是牡丹江市场重要的林蛙源。因此，有必要开展该地区东北林蛙重金属评价的研究，为东北林蛙的合理养殖和食品开发利用提供重要参考。

1　材料与方法

1.1　研究地区概况

牡丹峰国家级自然保护区位于黑龙江省牡丹江市区东南约15 km处，地处老爷岭山脉西北端，东与太平岭相接，西与张广才岭比邻。以保护牡丹峰珍贵的山地云冷杉、红松阔叶混交林及生物多样性资源为目的，总面积194.68 km2。保护区内有5种国家Ⅰ级和32种国家Ⅱ级重点保护动物，也是东北林蛙的主要分布区，林蛙主要以半人工方式养殖。保护区内的烟囱河为东北林蛙主要的越冬场所，是蛙卵人工孵化池的水源，并且中游段建有东北林蛙储存库［11，12］。

1.2　试验材料

于2016年4月，沿烟囱河上、中、下游附近对冬眠出蛰后的东北林蛙进行捕捉，同时取三个段位的河水备用分析。东北林蛙的体长与年龄密切相关，根据体长鉴定年龄［13］，将捕获的林蛙测定体长（精确到0.01 mm），鉴定得到一龄、二龄、三龄个体（其中四龄个体较少，归到三龄个体中分析）。因林蛙肌肉为人们常食用部位，故本研究仅以肌肉为分析样本，解剖获得腿部骨骼肌样品备用。每个年龄段雌雄各10份样品，共60份。

1.3　试剂与仪器

硝酸为高级纯，过氧化氢为优级纯，标准品购自国家标准物质中心。7700 Series电感耦合等离子体质谱仪（ICP－MS，Agilent Technologies），MDS－10 微波消解仪（上海新仪微波化学科技有限公司）。所用玻璃及聚四氟乙烯仪器均用5%硝酸溶液浸泡24 h以上，然后用去离子水冲洗，晾干后备用。

1.4　微波消解法

称取已处理的肌肉样0.5 g置于聚四氟乙烯微波消解罐中，加入8 mL HNO3（65%～68%）预处理20 min，补加 2 mL HNO3和 1 mL H2O2（30%）消解。 消解条件：130℃ 25 min；150 ℃ 10 min；200 ℃ 25 min，单罐功率均为400 W。消解冷却后，将聚四氟乙烯微波消解罐置于平板加热器上除酸，最后用去离子水定容至25 mL。7700 Series ICP－MS测定重金属浓度，最后换算为每千克肌肉样品含多少毫克的元素。

1.5　数据分析

采用SPSS 19.0软件，计算平均值和标准差；选择单因子方差分析（One－way ANOVA）进行河水不同河段之间重金属含量的差异显著性检验和不同年龄段间重金属含量的差异显著性检验；应用Pearson相关分析评价重金属与体长间、重金属间的相关性；相关性显著的，再利用线性回归建立线性模型。采用Excel 2003作图。

2　结果与分析

2.1　河水的重金属评价

本研究对保护区内东北林蛙越冬地的烟囱河上、中和下游河水重金属含量进行了分析。结果表明，三段河水中 6 种元素 As、Cd、Pb、Cr、Cu、Zn 的平均含量分别为 0.291±0.012、0.003±0.001、0.309±0.046、0.005±0.002、0.435±0.026、0.005±0.002 μg／L，并且各元素含量三段河水间差异不显著。与国家环境保护总局发布的国家标准GB 3838－2002《地表水环境质量标准》五类地表水标准相比，河水中的6种重金属含量均符合国家Ⅰ类标准，并且远低于Ⅰ类标准各元素的限量值。认为东北林蛙栖息地水质高于国家相关标准规定，该环境下所养殖的东北林蛙及其产品具有一定的安全性。

2.2　肌肉样品的重金属评价

捕获并用于分析的东北林蛙体长为33.39～70.29 mm，平均为 55.478 mm；体重 3.157～39.045 g，平均为18.794 g。根据参考文献［13］按体长进行年龄鉴定，共分出3个年龄段：一龄、二龄和三龄。重金属含量分析，发现Cr含量二龄显著高于一龄和三龄（P＜0.01），说明Cr在东北林蛙肌肉组织中富集能力较强。同时林蛙二龄达到性成熟，重金属的代谢能力增强，可能导致Cr含量二龄显著高于一龄和三龄［14］。其他元素含量各年龄段间无显著差异，说明As、Cd、Pb、Cu、Zn在肌肉组织中无富集现象（图1和图2）。

As、Cd、Pb、Cr、Cu、Zn 六种元素的平均含量为0.028±0.020 5、0.004±0.003 06、0.087±0.110 5、0.682±0.486 8、0.731±0.108 5 和 5.198±1.761 6 mg／kg。综合参考国家食品卫生标准GB 2762－2012《食品中污染物限量标准》、行业标准NY 5073－2006《无公害食品：水产品中有毒有害物质限量》和GB 13106－1991《食品中锌限量标准》，对 As、Cd、Pb、Cr、Cu、Zn的限量规定分别为 0.5、0.1、0.2、1.0、50、50 mg／kg。本研究的东北林蛙肌肉中的6种重金属均未超标，均达到了国家食品卫生标准。

图1　不同年龄段个体肌肉As、Cd、Pb的含量

图2　不同年龄段个体肌肉Cr、Cu、Zn的含量

2.3　体长与肌肉重金属含量的相关性分析

Pearson相关性分析，表明东北林蛙肌肉Cu含量与体长显著正相关（r＝0.624，P＜0.05）；Cd 与 Pb 含量存在极显著的正相关（r＝0.874，P＜0.01），其他元素间或与体长间均无相关性。说明林蛙一至三龄间肌肉Cu含量随着年龄增长有增加趋势，Cd与Pb含量具有一定的同源性。并对上述的正相关进行了线性回归，以建立线性模型。肌肉Cu含量与体长的线性关系为 Cu＝0.005 L＋0.436（R2＝0.389，P＜0.05）；Cd 与Pb含量的线性关系为 Cd＝0.024 Pb＋0.003 （R2＝0.765，P＜0.01）。

参考文献：

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［2］田秀华，赵文阁，柏永明，等.东北林蛙人工养殖存在问题及发展对策［J］.野生动物，2009，30（4）：214－216.

［3］顾佳丽.辽西地区食用鱼中重金属含量的测定及食用安全性评价［J］.食品科学，2012，33（10）：237－240.

［4］田新民，石兰英，魏 韬，等.东北林蛙矿物质元素含量的营养分析［J］.黑龙江畜牧兽医，2013（3）：140－141.

［5］ TÜRKMEN M，TÜRKMEN A，TEPE Y，et al.Determination of metals in fish species from Aegean and Mediterranean seas［J］.Food Chemistry，2009，113（1）：233－237.

［6］郭勇勇，华江环，杨丽华，等.三峡库区水样中重金属含量及其对斑马鱼胚胎发育的毒性评价［J］.水生生物学报，2015，39（5）：885－892.

［7］陈晓平，崔敬爱，胡耀辉.林蛙油主要营养成分的研究［J］.食品科学，2005，26（8）：361－363.

［8］ 李妍妍，郑卫星，王日昕，等.林蛙营养成分的多元分析［J］.食品科学，2007，28（12）：472－475.

［9］赵桂华，梁 悦，王 宇，等.中国林蛙肉的营养成分分析与评价［J］.营养学报，2007，29（6）：623－624.

［10］王彬彬，张文革，夏艳洁.中国林蛙腿肉的营养成分分析与评价［J］.经济动物学报，2012，16（2）：89－93.

［11］金志民，杨春文，刘 铸，等.黑龙江省牡丹峰自然保护区鸳鸯繁殖习性观察［J］.四川动物，2010，29（3）：489－491.

［12］高作锋，邓立斌，陈端吕.黑龙江牡丹峰国家级自然保护区的生态评价［J］.中南林业科技大学学报，2012，32（9）：106－109.

［13］马常夫.哈士蟆的年龄鉴定与种群结构的初步研究［J］.东北师大学报自然科学版，1985（1）：81－89.

［14］黄孝明，徐艳春，应 璐，等.半人工饲养条件下东北林蛙变态后的生长规律［J］.东北林业大学学报，2008，36（1）：63－65.