天然植物对小龙虾仁抗氧化效果的初步研究

周蓓蓓，陈小雷，鲍俊杰

克氏原螯虾（Procambarus clarkii）又称为淡水小龙虾（Freshwater c rawfish），原产于美国东南部，成体长 5.6～11.9 cm，属于杂食性淡水经济虾类。 小龙虾适应能力强，在水温为10～30℃时均可正常生长发育。亦能耐高温严寒，可耐受40℃以上的高温，也可在气温为－14℃以下的情况下安然越冬。小龙虾生长速度快，刚离开母体的幼虾生长2～3个月即可成熟并达到商品虾规格，其寿命一般为1年。目前，小龙虾在中国特别是长江中下游地区已经成为重要的淡水经济养殖品种，其养殖面积覆盖皖江流域、淮河流域。截至2015年，全国小龙虾养殖总产量达到 72.32 万 t，比 2014 年增长 9.63%，其中安徽省2015年小龙虾养殖产量达到9.72万t，仅次于湖北省，位居全国第二［1］，小龙虾养殖产量达到历史高峰，为小龙虾加工的发展提供了优厚的条件。

油脂氧化是自由基链反应，自由基的高反应活性能够导致机体损伤、细胞破坏、人体衰老等现象，油脂过氧化产物与食品中成分反应，不仅破坏食品外观、营养和品质导致劣变，还会产生致癌物质，同时，油脂过氧化物及其降解产物（醛、酮、酮酸等）还可与蛋白质发生反应，使其氧化。蛋白质氧化包括蛋白质肽链断裂、蛋白质分子相互间交联聚合、蛋白质氨基酸发生氧化脱氨反应、自由基攻击蛋白质还原性基团、脂类氧化裂解所产生的丙二醛与蛋白质上的氨基产生分子间交联等［2］。上述氧化损伤和修饰造成蛋白质结构和功能的改变，并参与了氧化应激、衰老和多种疾病的发生和发展［3，4］。如热处理等一些加工保藏方法可能促进蛋白质氧化而影响肉品食用品质、加速肉类劣变［5］。

添加抗氧化剂是一种使用广泛、有效简便防止食品氧化的方法。研究表明，常规抗氧化剂BHT、BHA和TBHQ会引起肝肿大，BHT还会使肺和肝微粒体酶的活性增加，使人体摄入的其他物质转变为有毒物或致癌物［6］。目前，美国、欧共体等已经禁止使用人工合成抗氧化剂［7］，因此，开发天然抗氧化剂成为必要。抗氧化的研究集中在油脂抗氧化，蛋白质的氧化涉及甚少。现有研究表明，除了常规天然抗氧化剂抗坏血酸、维生素E之外，一些天然香料、药物等植物中也含有大量抗氧化活性物质，其中包括黄酮类、苯酚类（多酚）、皂苷类、鞣质类、生物碱类、多糖类等化合物［8］，包括迷迭香、丁香等香料植物提取物，茶多酚类化合物、精油类化合物、丹酚酸等多酚类化合物等，天然抗氧化剂除了植物性成分外，还包含从虾头、动物蛋白质等组织中提取的肌肽、多肽等抗氧化肽动物性成分，不仅如此，天然抗氧化剂常常会多种成分复配使用，以期达到更好的效果［9－13］。

现有天然抗氧化剂研究集中在抗油脂氧化，研究对象多为鱼、猪等肉类，对小龙虾的天然抗氧化剂研究鲜见报道。本试验选取6种天然药食同源植物及香料植物，这些植物均可以在烹饪过程中直接加入，通过制得的抗氧化液对小龙虾仁进行处理，以虾仁的脂肪及蛋白质双重氧化程度作为指标，考察不同天然抗氧化剂对小龙虾仁脂肪和蛋白质的不同抗氧化效果，以期为开发水产品天然无害抗氧化剂提供一定的理论依据。

1　材料与方法

1.1　材料、试剂与仪器

小龙虾仁购于合肥市四里河路与北二环路交口永辉超市，挑选大小均一、较为活泼且体色发青的鲜活小龙虾，开水烫漂2 min后剥壳去虾线、虾黄，取虾仁进行试验。

三氯乙酸（TCA）、EDTA、氯化钠、2－硫代巴比妥酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、2、4－二硝基苯肼（DNPH）、乙酸乙酯、盐酸胍、盐酸、十二烷基硫酸钠（SDS）、 三羟甲基氨基甲烷 （Tris）、5，5′－二硫代双（2－硝基苯甲酸）（DTNB）分析纯，购于合肥君德生物科技有限公司。

CR22GIII型高速冷冻离心机 （日本Hitachi公司）；HC－3018型高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；754型紫外可见分光光度计 （上海洪纪仪器设备有限公司）；FA25型高速匀浆机［FLUCO弗鲁克（上海）公司］。

1.2　方法

1.2.1组分筛选法制取浸渍液及样品处理 选取丁香、迷迭香、肉桂、鼠尾草、香茅草和紫苏6种（可能）具有抗氧化效果的药食同源植物或香料植物，采用组分筛选法［14］对这6种植物进行组合并制浸渍液，以白开水浸泡的样品为空白，以6种植物全加制浸渍液处理的样品为参照，其他样品为5种（扣除1种）植物制浸渍液处理的样品。浸渍液制取及样品处理方法：每种植物取10 g，加1 000 mL水，大火煮开后小火炖煮15 min左右，篦去植物并以开水补足1 000 mL，晾凉至 50 ℃以下以 1∶2 的料液比（g∶mL）浸泡龙虾肉4 h以上，之后4℃冷藏5 d后进行下一步试验，样品的组合见表1。

按照表1中的设计对选择的6种天然药食同源植物或香料植物（简称天然植物）进行组合，按照不同组合制取腌渍液对样品进行处理。经过不同设计的天然植物腌渍液处理后的小龙虾仁样品编号与天然植物组分筛选设计编号相同。

表1　6种天然植物组分筛选设计

1.2.2TBARS 测定 脂肪氧化程度根据文献［15，16］的方法测定并稍有改动，取3.00 g虾仁样品加入30 mL 7.5%（m／V） 的三氯乙酸 （含 0.1%EDTA），15 000 r／min 匀浆 60 s，4 ℃的条件下 6 000 r／min 离心 10 min，过滤，532 nm处测吸光度A1，滤液5 mL加入5 mL 0.02 mol／L 2－硫代巴比妥酸（TBA）溶液，沸水浴40 min，冷却至室温，532 nm处测吸光度A2。

1.2.3肌原纤维蛋白提取 肌原纤维蛋白提取按照文献［16，17］的方法并作一定改动，称取4 g龙虾仁加入 60 mL缓冲溶液 A（0.02 mol／L磷酸盐缓冲液，含 0.1 mol／L NaCl，0.001 mol／L EDTA，pH 7.0），混匀后 15 000 r／min 匀浆 60 s，4 ℃下 6 000 r／min 离心10 min，取沉淀，再加入6倍体积的缓冲液A，相同的条件下离心取沉淀，沉淀即为肌原纤维蛋白提取物。

1.2.4蛋白质羰基含量测定 蛋白质羰基含量根据文献［16，18］的方法并稍作改动，取 0.2 g 肌原纤维蛋白溶于 10 mL 磷酸盐缓冲溶液 B（0.025 mol／L 磷酸盐缓冲液，含 0.6 mol／L NaCl，pH 7.0），冰浴 2 h溶解，6 000 r／min离心10 min，取上清液在370 nm处测定吸光度A1，之后取2 mL相同浓度肌原纤维蛋白溶液加入 2 mL 0.01 mol／L 的 DNPH（对照组加入2 mol／L HCl），室温下黑暗处静置 1 h（每个 10 min振荡一次），然后加入2 mL 20%的TCA，10 000 r／min离心 15 min，再用 5 mL 乙酸乙酯∶乙醇（1∶1）洗涤沉淀2次，取沉淀加入5 mL盐酸胍溶液（6 mol／L，溶于 0.02 mol／L 磷酸钠缓冲液，pH 6.5），37 ℃条件下溶解沉淀20 min，10 000 r／min离心 5 min， 取上清液在370 nm处测定吸光度A2。

1.2.5蛋白质巯基含量测定 蛋白质巯基含量根据文献［19，20］的方法并稍作改动，取 0.25 g 肌原纤维蛋白加入 10 mL 0.1 mol／L Tris 缓冲溶液（含 5%SDS，pH 8.0），80 ℃水浴 2 h，之后 4 500 r／min 离心15 min，取上清液 0.5 mL 加入 2 mL 5%SDS／Tris缓冲溶液，在412 nm处测定其吸光度A1，之后加入0.5 mL 0.01 mol／L DTNB （溶于上述缓冲溶液），摇匀后避光反应30 min，在412 nm处测量吸光度A2。1.2.6 数据统计分析 采用 SPSS17.0软件对多组数据之间的差异显著性进行分析，结果采用平均值±标准差的形式表示，用F检验里的Duncan′s多重检验进行差异显著性分析，P取0.05。

由于浸渍液系植物原株煮制而成，带有不同程度的颜色，因此为除去颜色干扰，在TBARS、蛋白质羰基和蛋白质巯基含量的测定中采用吸光度变化幅度（A1－A2和 A2－A1）来表示样品脂肪氧化及蛋白质氧化程度。

2　结果与分析

2.1　小龙虾仁TBARS比较分析

TBARS与脂肪的氧化程度有良好的正相关性，因此TBARS常被用于评价水产品品质变化的指标［21］，其原理是不饱和脂肪酸氧化降解产物丙二醛（MDA）与硫代巴比妥酸（TBA）反应并生成稳定的红色化合物［22］，以此化合物测定的吸光度大小表示脂肪氧化程度。以添加TBA反应前后的吸光度差值作为不同腌渍液处理样品的抗脂肪氧化能力的大小，A1－A2的数值越大表示抗脂肪氧化能力越强（表2）。

由表 2 可知，A1－A2的大小顺序为 5≈1＞2＞3＞4＞7＞6＞8，样品 7是 6种植物全加的参照，样品 8是空白样，由以上抗脂肪氧化的排序得知样品7（参照）排序靠后，说明6种植物之间存在较为强烈的拮抗作用，而根据其他样品与参照样7的对比可知，腌渍液缺少紫苏会削弱样品抗脂肪氧化能力，而腌制液缺少丁香、迷迭香、肉桂、鼠尾草和香茅草会增强样品的抗脂肪氧化能力。因此，说明紫苏在6种植物中具有最好的抗脂肪氧化效果。

2.2　小龙虾仁蛋白质羰基含量比较分析

羰基的形成是蛋白质氧化的一个明显标志，蛋白质侧链上带有NH－或NH2－基团的氨基酸对自由基非常敏感，蛋白质氧化过程中，这些基团可转化成羰基基团；活性氧会导致蛋白质肽链断裂，在断裂处也可能形成羰基［20，23］。 肌原纤维蛋白一般占肉类全蛋白质含量的60%～70%，因此，肌原纤维蛋白中羰基含量是评价肉制品蛋白质氧化程度的有力指标［20，24，25］。羰基含量越高，说明蛋白质氧化程度越深。以添加DNPH反应前后的吸光度差值作为不同腌渍液处理样品的抗蛋白质氧化能力的大小，A1－A2的数值越大表示抗蛋白质氧化能力越强（表3）。

表2　小龙虾仁抗氧化处理前后原始TBARS变化

蛋白质羰基含量的数值越大，表示蛋白质氧化程度越高，因此吸光度变化情况（A1－A2）的数值越大，表示蛋白质羰基含量下降越多，也就是说抗蛋白质氧化能力越强。由表3可知，A1－A2的大小顺序为1＞7＞3＞2＞4＞5＞6＞8，6 种植物全加的参照样品 7 排序靠前，说明6种植物间存在较小的拮抗作用，根据其他样品与参照样品7的对比可知，腌渍液缺少丁香会增强样品抗蛋白质氧化能力，而腌制液缺少迷迭香、肉桂、鼠尾草、香茅草和紫苏会削弱样品的抗蛋白质肪氧化能力。因此，说明组合1即迷迭香、肉桂、鼠尾草、香茅草和紫苏具有最强的抗蛋白质氧化能力。

2.3　小龙虾仁蛋白质巯基含量比较分析

巯基是蛋白质分子中具有较高反应活性的基团，巯基的硫外层具有很多孤对电子，具有强烈的亲核性［20，26］。巯基对氧化反应比较敏感，蛋白质在氧化过程中，巯基转换成二硫键是初期的一个反应产物，巯基的含量变化可显示出蛋白质的变性程度［20，27，28］。巯基含量越低表示蛋白质氧化程度越高。以添加DTNB反应前后的吸光度差值作为不同腌渍液处理样品的抗蛋白质氧化能力的大小，A2－A1的数值越大表示抗蛋白质氧化能力越强（表4）。

蛋白质巯基含量的数值越大，表示蛋白质氧化程度越低，因此吸光度变化情况（A2－A1）的数值越大，表示蛋白质巯基含量上升越多，也就是说抗蛋白质氧化能力越强。由表4可知，A2－A1的大小顺序为6＞8＞1＞4＞2＞5＞7＞3，参照样 7 排位靠后，空白样排在第二，几种组合之间的差异不明显。通过其他样品与空白样8的比较可知：腌渍液中缺少紫苏能够增强样品的抗蛋白质氧化能力，也就是说组合6即丁香、迷迭香、肉桂、鼠尾草和香茅草具有最强的抗蛋白质氧化能力，与蛋白质羰基含量的分析结果进行组合分析，组合迷迭香、肉桂、鼠尾草和香茅草具有较好的抗蛋白质氧化效果。

表3　小龙虾仁抗氧化处理前后原始蛋白质羰基含量变化

表4　小龙虾仁抗氧化处理前后原始蛋白质巯基含量

3　讨论

以6种天然药食同源植物和香料植物为研究对象，采用不同组合制取腌渍液对小龙虾仁进行处理，选取TBARS、蛋白质羰基含量和巯基含量为指标，考察其对小龙虾仁脂肪及蛋白质的不同抗氧化效果，结果表明，紫苏具有6种植物中最好的抗脂肪氧化效果，这可能解释了为什么烹饪鱼的过程中添加紫苏能够有效祛除腥味，紫苏在一定程度上防止脂肪分解氧化产生小分子腥味化合物；丁香对抗蛋白质氧化的效果破坏最大，组合迷迭香、肉桂、鼠尾草和香茅草具有最好的抗蛋白质氧化效果；以蛋白质羰基含量为考察指标能够较为明确地指示各植物组分的抗蛋白质氧化效果，各组合之间存在显著差异（P＜0.05），以蛋白质巯基含量为考察指标各组合之间相似度较高，不能够明确指示抗蛋白质氧化效果。

天然植物含有的活性成分复杂多样，一些黄酮类、酚酸类、苯丙素类等化合物由于其特殊结构，具有不同程度的抗氧化活性，如迷迭香中的迷迭香酸、鼠尾草中的鼠尾草酸。值得注意的是，紫苏具有最好的抗脂肪氧化效果，而丁香具有明显的促进蛋白质氧化的效果，这可能与植物本身所含有的活性物质有关，需要更深层次的研究。

脂肪和蛋白质氧化原理不尽相同，一般来说，脂肪氧化是由于不饱和脂肪酸双键的易氧化性，而蛋白质结构较为复杂，氧化包括含N、含S基团的活泼易变特性。因此，本研究选取的6种天然药食同源植物或香料植物在抗脂肪氧化和抗蛋白质氧化的效果特性上并不相同，在实际生产过程中，需要根据产品本身的特性（脂肪、蛋白质含量多寡）来选用合适的天然抗氧化剂。

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