环介导等温扩增技术检测山羊奶中的牛奶成分

李婷婷，赵路遥，张桂兰，赵晓燕，赵志勇，陈爱亮

1.中国农业科学院 农业质量标准与检测技术研究所，北京100081；2.上海农业科学院 农业质量标准与检测技术研究所，上海201403

羊奶不但营养丰富，同时还可防止过敏，近年来在中国乳制品消费中增长迅速。然而，在乳制品行业中，羊奶掺假现象屡见不鲜。迄今已建立了多种乳制品鉴别方法，主要包括基于蛋白质的检测方法，如电泳[1]、免疫学技术和色谱分析技术[2-3]。一些研究指出，ELISA 可准确检测奶类掺假。然而，由于蛋白质易受热和盐的影响而变性，导致交叉反应，因此，蛋白质检测方法不利于已加工产品的检测。核酸检测技术作为一种生物学方法已被广泛认为可以替代蛋白质检测方法对奶类掺假进行鉴别。Martin[4]开发了一种聚合酶链式反应（PCR）方法，针对12S RNA 线粒体基因设计特异性引物，从而实现对山羊、绵羊和牛奶的鉴别，牛的基因片段长度为84 bp，绵羊为121 bp，山羊为122 bp。实验结果表明，其灵敏度可达0.1%，即使奶类制品放置时间延长，此方法也十分稳定。Zha[5]建立了一种检测鹿产品的多重PCR 检测方法，针对16S rDNA 基因的D 环和保守区设计特异性引物，用于梅花鹿、马鹿和驯鹿的特异性鉴定，可分别产生307、230 和141 bp 的特异性片段。多重PCR 是鉴定产物来源的有效、可靠的方法。Abdel-Rahman[6]开发了用于鉴定羊奶、牛奶的PCR 和PCR-RFLP 技术，用线粒体细胞色素b 区段（Cyt-b，359 bp）的PCR-RFLP的限制性分析显示了各种乳样品之间的差异，提供了一种快速、特异和灵敏的检测方法，适用于物种特定成分的检测和鉴定。Dalmasso[7]建立了一种实时荧光定量PCR 方法，以区分乳制品中的牛及水牛源性成分，可检测到混合奶中2%的牛奶成分，且无需任何PCR 后操作。尽管目前已开发出基于蛋白质和核酸的检测乳类制品的方法，但这些技术不仅需要熟练的操作技能和昂贵的设备，且扩增耗时漫长。环介导等温扩增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）以其可在等温条件下快速扩增DNA 片段并进行可视化观察而成为研究热点，目前已有鉴别不同物种的LAMP 检测方法[8-11]。

我们采用LAMP 检测技术对羊奶是否掺假进行鉴别，这种方法需要特殊引物。我们对引物的特异性和敏感度进行了实验，并对市售的6 种不同奶制品做了分析。

1 材料和方法

1.1 材料

山羊奶和牛奶样品来自北京的养殖场，无菌收集鲜奶，立即在冷链条件下以无菌方式将样品转移到实验室；商业羊奶来自北京不同的超市。用TaKaRa Genomic DNA 提取试剂盒提取DNA，NanoDrop 2000 分光光度计（赛默飞）测定DNA 的纯度和浓度，浓度为10 ng/mL，其D260nm/D280nm值为1.7～2.0，可用于后续LAMP。

1.2 样品制备

将山羊奶与牛奶按不同比例（100∶0，99∶1，95∶5，90∶10，75∶25，50∶50，25∶75，10∶90，5∶95，1∶99 和0∶100）混合制备样品，提取DNA 用于后续扩增。

1.3 特异性引物设计

在NCBI 数据库中搜索山羊GAPDH 基因和牛的Cyt-b 基因序列，并针对这些序列用Primer Ex⁃plorer V5 软件（http://primerexplorer.jp/）设计LAMP特异性引物组（表1），由上海生工公司合成。

表1 LAMP 引物设计

1.4 LAMP反应

LAMP 反应总体积为25 μL，包括引物FIP、BIP 各1.28 μmol/L，引物F3、B3 各0.16 μmol/L，BstDNA 聚合酶8 U，dNTP（北京燕栖湾生物技术有限公司）1.4 mmol/L，Tris-HCl（pH8.8）20 nmol/L，KCl 10 mmol/L，（NH4）2SO410 mmol/L，MgSO48 mmol/L，Tween-20（北京生物生工科技有限责任公司）0.1%，提取的DNA 2 μL，钙黄绿素2.5 μmol/L。将反应混合物于60℃温育45 min，然后加热至80℃并保持5 min 以终止反应。如果有扩增反应，则混合物的颜色从橙色变为绿色，否则反应混合物仍保持橙色。

1.5 荧光定量PCR

为了证明牛和山羊引物的特异性，我们用实时PCR 反应扩增不同的动物模板，反应体系主要包括引物FIP、BIP 各1.28 μmol/L，引物F3、B3 各0.16 μmol/L，BstDNA 聚 合 酶8 U，dNTP 1.4 mmol/L，Tris- HCl（pH8.8）20 nmol/L，KCl 10 mmol/L，（NH4）2SO410 mmol/L，MgSO4，8 mmol/L，Tween-20 0.1% ，提 取 的DNA 2μL，EvaGreen 1.25 μL。反应程序：60℃ 40 s，61℃ 40 s，45 个循环，然后80℃5 min。

1.6 灵敏度和实际样品检测

为了确定实验的灵敏度，将不同体积的山羊奶和牛奶混合，提取DNA 进行LAMP。为了测试所开发的方法在实际样品中的适用性，从北京的不同市场购买了6 种山羊奶产品，并分别用山羊和牛引物进行扩增反应。

图1 LAMP 引物特异性

2 结果

2.1 特异性实验

针对羊的GAPDH 基因和Cyt-b 基因设计物种特异性引物，荧光定量PCR 扩增不同的模板。结果如图1，采用羊引物进行扩增时，只有含羊模板反应出现扩增曲线，而不含羊模板未出现扩增；当使用牛的特异性引物进行扩增时，只有含牛模板反应出现扩增曲线，而不含牛模板反应未出现扩增。

2.2 灵敏度实验

为了确定实验灵敏度，将山羊奶与牛奶按不同比例混合后提取DNA，分别采用山羊特异性引物和牛特异性引物进行LAMP。结果见图2，用山羊引物扩增时其颜色由绿色逐渐变为橙色，而用牛引物扩增时其颜色由橙色逐渐变成绿色。

2.3 商业样品检测

为了验证方法的实用性，对北京市场购买的6 种不同的羊奶产品进行了检测。结果见图3，用羊引物扩增时反应均从橙色变为绿色，而用牛引物扩增时，其中5 号样品（第8 管）的反应由橙色变为绿色，说明此羊奶产品中含有牛源性成分（图3）。

3 讨论

目前已开发出多种乳制品掺假检测技术，主要包括ELISA、毛细管电泳、色谱技术，但这些技术往往需要专业的操作人员，耗时较长。随着核酸检测技术的发展，一些生物化学方法逐渐被报道，基于DNA 的检测技术以其灵敏、特异等优点逐渐成为主流。其中基于DNA 的PCR 检测技术虽灵敏度高、特异性好，且Bottero[12]研发了一步法检测牛和水牛成分的PCR 方法，但PCR 检测需要昂贵的仪器，因此不适合现场检测。

本研究中，我们设计了山羊与牛的特异性引物，用于山羊奶的快速可见检测，灵敏且直观。与传统PCR 技术相比，LAMP 无需特殊设备，65℃50 min 即可完成。本研究建立的LAMP 检测技术可检测到含量为1%的牛奶成分，用钙黄绿素染料可直接对检测结果进行观察，可以满足现场快速检测的要求，有助于未来奶制品现场检测方法的开发。

图2 引物灵敏度

图3 6 种商品奶的检测