纳米磁珠偶联CFP-10特异性单抗富集结核分枝杆菌方法的建立

张佳，张景海，冯晓燕，张贺秋

1.沈阳药科大学，辽宁 沈阳110016；2.东方海洋（北京）医学研究院，北京100070

结核病是通过呼吸道传播，由结核分枝杆菌感染引起的传染病，随着病情不断恶化而导致全身多系统疾病[1]，严重损害人类健康。据世界卫生组织（WHO）统计，2016年全球新发现的结核病例约1040 万，中国新发病例占全球的8.6%[2]，是排名世界第三的结核病高负担国家，结核病疫情的防控刻不容缓。目前结核病的诊断仍主要依赖于传统的结核分枝杆菌培养和痰涂片抗酸染色[3]。涂片抗酸染色镜检观察法是细菌学检测常用的方法，但是由于敏感性低，对细菌的数量要求较高，只有当痰液中细菌数达到5000～10000/mL 才能检测到抗酸菌，阳性检出率较低。因此，对标本中致病菌进行富集，对提高细菌学检查的阳性率至关重要。传统的富集方法存在各种不足，仍满足不了临床需要。作为一种新型富集方法，磁珠富集法受到越来越多研究者的关注，正逐渐应用到结核病的诊断中。

培养滤液蛋白10（culture filtrate protein 10，CFP-10）由结核分枝杆菌的RD1 区基因Rv3874编码[4]，在体内和早期分泌抗原靶蛋白6（ESAT-6）形成1∶1 异二聚体复合物而发挥生物学功能，激发强烈的特异性T 细胞应答[5]。由于CFP-10 所在的RD1 区只存在于结核分枝杆菌和牛分枝杆菌中，而其他分枝杆菌及卡介苗（BCG）中均缺失该区序列[6]，因此成为结核病诊断研究的热点。我们制备了CFP-10 特异性单抗，并将该抗体与纳米磁珠偶联，用于捕获富集结核分枝杆菌，以期能够提高痰样本抗酸染色检测的阳性检出率。

1 材料和方法

1.1 材料

雄性BALB/c 小鼠（8～10 周龄）购自北京维通利华实验动物有限公司；结核分枝杆菌H37Rv 株由中国疾病预防控制中心提供；大肠杆菌HB101感受态由本实验室保存；原核表达质粒pBVIL1 由本实验室构建并保存；抗CFP-10 单克隆抗体杂交瘤细胞株1028 为本实验室前期制备保存；DNA限制性内切酶XhoⅠ、XbaⅠ及T4DNA 连接酶购自Promega 公司；琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒及质粒小提试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；Ni Sepharose 6 Fast Flow 购自GE Health⁃care 公司；RPMI-1640 培养基购自Gibco 公司；胎牛血清购自康源生物公司；琥珀酰亚胺磁珠购自上海医脉赛生物科技有限公司。

DYY-10C 电泳仪（北京六一仪器厂）；PCR仪、Bio-PlexPro Wash Station（BIO-RAD 公司）；3-18K 低温高速离心机（Sigma 公司）；酶标板（厦门怡佳美实验器材有限公司）。

1.2 CFP-10抗原制备

1.2.1 重组质粒的构建及鉴定 以结核分枝杆菌H37Rv株的DNA为模板，针对CFP-10的开放读框设计扩增引物CFP-10-F（5′-GCGTCGACGAA GCAGCCAATAAGCAG-3′，下划线序列为SalⅠ酶切位点）和CFP-10-R（5′-GCTCTAGAATGGTGAT GGTGATGGTGCGAGGACAGCGCCTGCTG-3′，下划线序列为XbaⅠ酶切位点）。PCR 扩增，片段酶切后连接到原核表达载体pBVIL1，构建pBVIL1-CFP-10 重组质粒，将重组质粒转化大肠杆菌HB101 感受态，挑取单菌落送北京天一辉远生物科技有限公司测序鉴定。

1.2.2 目的蛋白表达及纯化 将测序正确的重组表达质粒转化大肠杆菌HB101 感受态，挑取单菌落于3 mL 含氨苄西林钠的LB 液体培养基中，37℃振荡培养过夜，次日接种于新鲜的LB 液体培养基中培养至对数期后于42℃过夜诱导。SDSPAGE 分析目的蛋白及表达形式。将pBVIL1-CFP-10 菌液扩大培养发酵，Ni 柱亲和层析纯化蛋白，紫外分光光度计测定蛋白浓度。

1.3 CFP-10单抗制备

1.3.1 单抗制备与纯化 复苏1028 杂交瘤细胞，用含10%胎牛血清的1640 培养基培养；每只BALB/c小鼠腹腔注射0.5 mL液体石蜡，10 d 后收集细胞，用10 mL 生理盐水重悬细胞，每只小鼠腹腔注射0.5 mL（细胞密度约为1×107/mL）；2周后收集腹水，硫酸铵沉淀法纯化抗体。

1.3.2 ELISA 法测抗体效价 用碳酸盐包被缓冲液稀释CFP-10 抗原浓度为2.5 μg/mL，每孔包被100 μL。用抗体稀释液分别将CFP-10 单抗稀释至1/10、1/100、1/1000、1/10000、1/20000、1/40000、1/80000、1/160000、1/320000、1/640000、1/1280000，100 μL/孔加样并设置空白孔（100 μL 抗体稀释液）。用酶标仪双波长（450 nm/630 nm）测定各孔的吸光度值。

1.3.3 磁珠偶联CFP-10 单抗 取50 μL（2.5 mg）纳米磁珠（粒径300 nm）于EP 管中，用洗涤缓冲液洗涤磁珠，磁场吸附，弃上清；用偶联缓冲液重悬磁珠和稀释CFP-10 单抗；将等体积的重悬磁珠和偶联蛋白溶液置于旋转混合仪中，4℃振荡过夜；磁场分离磁珠，移除含蛋白的上清液，紫外分光光度计测定蛋白浓度；加入封闭缓冲液重悬磁珠，置于旋转混合仪中，室温混合4 h；磁场吸附，弃上清；用封闭缓冲液洗涤偶联蛋白的磁珠，磁场吸附，弃上清；用1 mL 封闭缓冲液重悬磁珠，于2～8℃储存。

1.4 磁珠偶联CFP-10单抗的验证

1.4.1 HRP 标记CFP-10 单抗 用碳酸盐缓冲溶液调整CFP-10 单抗浓度为5 mg/mL 待用。用分析天平称量10 mg HRP，溶于蒸馏水中避光搅拌；缓慢滴加NaIO4水溶液避光搅拌；缓慢滴加乙二醇室温搅拌；将活化好的HRP 溶液分2 等份加入2 种抗体中，4℃透析过夜；加NaBH4混匀，4℃冰箱中放置2 h；加等体积的甘油混匀，-20℃保存。

1.4.2 双抗体夹心ELISA 法测定 偶联CFP-10单抗的磁珠用PBS 缓冲液稀释至1/10，100 μL/孔；调整CFP-10 抗原浓度依次为1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL、0.125 μg/mL、62.5 ng/mL、6.25 ng/mL，每孔加入100 μL（对照组无关抗原稀释同上）；室温振荡孵育1 h，磁珠洗板机洗涤5次；酶稀液稀释HRP 标记的CFP-10 单抗，100 μL/孔；室温振荡孵育30 min，磁珠洗板机洗涤5次；显色液A 与显色液B（1∶1）混合，100 μL/孔，37℃避光10 min；硫酸终止液50 μL/孔终止反应；采用酶标仪双波长（450 nm/630 nm）测定各孔的吸光度值。

1.4.3 免疫荧光法测定 取10 μL 偶联抗体的磁珠及等量未偶联抗体的空磁珠，均匀涂在黏附性玻片上自然晾干；分别设置实验组（偶联抗体的磁珠+二抗）、对照组（空磁珠+二抗）；山羊抗小鼠FITC 标记的二抗用PBS 稀释至1/200 后加100 μL覆盖在磁珠上，避光孵育1 h；PBS 洗涤后用50%甘油封片，荧光显微镜下观察。

1.5 磁珠富集结核分枝杆菌抗酸染色

用超声波细胞破碎机将结核分枝杆菌聚集的团块分散，紫外分光光度计测得吸光度值，计算结核分枝杆菌浓度，详情参考文献[7]。将已知浓度的结核分枝杆菌稀释后取总菌量为50 000、3000 和300 的分枝杆菌，均分成2 份，设置实验组与对照组。实验组：不同总菌数的结核分枝杆菌悬液加入稀释至1/10 后体积为10 μL 的偶联抗体的磁珠，加PBS 缓冲液使各组混悬液体积补齐至100 μL，室温振荡富集1 h 后进行抗酸染色。对照组：直接将同等总菌数的结核分枝杆菌悬液涂片后进行抗酸染色。

2 结果

2.1 CFP-10抗原制备

2.1.1 CFP-10 基因的克隆及鉴定 琼脂糖凝胶电泳结果表明，CFP-10 基因的PCR 扩增产物与预期大小一致，基因长度为111 bp（图1）。

2.1.2 CFP-10 的诱导表达及纯化鉴定 SDSPAGE 分析pBVIL1-CFP-10 诱导表达菌液，目的蛋白主要以包涵体形式表达。重组蛋白由150 个氨基酸残基的pBVIL1 重组载体和37 个氨基酸残基的目的蛋白CFP-10 组成，在相对分子质量23×103处有比较明显的特异蛋白表达带，与预期大小相符（图2）。pBVIL1-CFP-10 菌液扩大培养发酵，Ni 柱亲和层析纯化蛋白，紫外分光度计测定CFP-10 抗原浓度为0.7 mg/mL。

2.2 CFP-10单抗制备

硫酸铵沉淀法纯化小鼠腹水中的CFP-10 单抗，紫外分光光度计测得单抗浓度为6.5 mg/mL，ELISA 法测得单抗效价为1∶640 000（图3）。

2.3 磁珠偶联CFP-10单抗及验证

图1 CFP-10 基因扩增结果

磁珠偶联加入CFP-10 单抗7.5 mg。偶联后经磁场移除磁珠的上清液CFP-10 单抗剩余量为5.8 mg，计算出磁珠偶联上CFP-10 单抗1.7 mg。双抗体夹心法偶联抗体能检测到抗原的最低浓度为62.5 ng/mL（图4）。免疫荧光实验显示偶联上抗体的磁珠与FITC 标记的二抗孵育后可见荧光，而对照无荧光（图5）。

图2 CFP-10 表达的SDS-PAGE 鉴定

图3 CFP-10 单抗抗体效价鉴定

图4 磁珠偶联CFP-10 单抗ELISA 鉴定折线图

图5 偶联CFP-10 特异性单抗磁珠的免疫荧光鉴定图（×40）

图6 结核分枝杆菌抗酸染色图（×100 油镜）

2.4 磁珠富集结核分枝杆菌抗酸染色

将结核分枝杆菌调整为总菌数分别为50 000、3000、300 的菌悬液，设置为利用偶联CFP-10 特异性单抗进行富集的实验组和未进行富集的对照组，分别进行抗酸染色，结果如图6。与对照组相比，含不同数量菌悬液的3 个实验组中结核分枝杆菌均明显多于对照组，且结核分枝杆菌多富集在磁珠周围，说明磁珠偶联CFP-10 特异性单抗能有效富集结核分枝杆菌。

3 讨论

2014年世界卫生大会提出到2035年消灭全球结核病预防、控制和治疗策略[8]，这给发展中国家结核病防控提出了严峻挑战。目前结核病的检测仍主要依赖于细菌学方法，富集结核分枝杆菌能提高结核病的阳性检出率，对于结核病的预防和控制至关重要。传统的富集方法仍存在各种不足，如离心沉淀法在操作中样本暴露在外，存在生物安全隐患；漂浮集菌法高压灭菌时间相对较长，但漂浮到液面的结核分枝杆菌仍不能保证完全黏附在玻片上，并受实验者主观因素影响；夹层杯法富集后导致严重背景干扰，易出现假阳性，影响最终实验结果。近年来，国外介绍了利用超顺磁性颗粒珠富集分枝杆菌，因其具有快速简便、不需要特殊仪器、稳定性高、无须冷藏保存等优点，除了被用来分离富集标本中的细菌及细胞外[9-10]，也有将其用于富集分枝杆菌，尤其是免疫磁珠。Grant 等[11]用磁珠连接抗副结核分枝杆菌的多克隆抗体，通过外加磁场沉淀牛奶标本中的副结核分枝杆菌，沉淀物用金胺“O”荧光染色镜检。

本研究首次用纳米磁珠偶联针对致病性结核分枝杆菌抗原的CFP-10 单抗。CFP-10 所在的RD1 区只存在于结核分枝杆菌和牛分枝杆菌中，因此我们制备的免疫磁珠增加了结核分枝杆菌的特异性。本实验结果表明，实验组纳米磁珠偶联上CFP-10 特异性单抗富集结核分枝杆菌总数明显多于对照组，且被染成紫红的结核分枝杆菌与纳米磁珠的褐色背景形成鲜明的颜色对比，在镜下形态清晰容易找到，富集效果良好，证明了初步建立的富集方法可行，为提高结核病临床细菌学检测的阳性检出率奠定了基础。