氨基酰化酶-1在肝癌组织中的表达及其临床意义＊

黄驿胜，王竞枫，林 枫，叶启文，李林立，张代场

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我国常见的恶性肿瘤之一。目前，我国HCC患者约占全球的 55%，已成为发病率最高的国家［1，2］。 肝癌的发生与遗传、环境等多种因素相关，如肝炎病毒感染、黄曲霉素的摄入、寄生虫感染、氯仿等。其中，大多数肝癌的发生都是由肝炎病毒（HBV、HCV）的感染造成的［3］。HCC发病机制隐匿，早期诊断困难，进展期快，恶性度高，术后高复发，预后性差给社会和医疗体系造成了巨大的负担。不少患者在就诊时肿瘤已经发展到了中晚期，失去了最佳治疗机会，即使是接受了手术，预后依然很差，5年总体生存期仍不理想［4］。因此，如何更加有效地防治HCC成为进一步提高患者生存率的主要问题。

氨基酰化酶-1（ACY-1）是一种含锌金属酶，广泛分布于各种组织，基因定位于3p21［5］。ACY-1主要参与生物体内氨基酸代谢，专一水解N-酰基-L-氨基酸的酰胺键形成L-氨基酸，而L-氨基酸参与机体代谢过程，具有生理活性［6-8］。遗传性ACY-1表达缺失会造成代谢异常，致使神经系统出现症状，表现为尿液中N-乙酸氨基酸的检出增加。ACY-1在不同肿瘤组织中的表达趋势也有所不同。在肾癌、肺癌、神经母细胞瘤组织中ACY-1表达下调，结直肠癌组织中ACY-1表达上调，而ACY-1在结直肠癌组织中的高表达预示结直肠癌患者预后不良。此外，Mitta和Tsunasawa等通过对大肠癌细胞、小鼠黑色素瘤细胞中ACY-1的表达进行研究发现，ACY-1在抑癌方面有着重要的作用［9］。由此推测ACY-1可能在肝癌的发生发展中起着重要作用，或许是潜在的肝癌预后评估的分子标志物。

为探讨ACY-1在肝癌中的表达及其作用，笔者收集手术切除的新鲜肝癌组织及配对癌旁组织，利用qRT-PCR技术和免疫印迹的方法分别对HCC患者的癌组织和相应癌旁组织中的ACY-1 mRNA和蛋白的表达水平进行检测。另外，同时结合免疫组化的方法，分析了手术切除、病理科存档的HCC患者石蜡标本中ACY-1蛋白的表达水平及其与临床病理参数之间的相关性，以期为肝癌的诊断、治疗提供依据。

1　资料与方法

1.1一般资料 HCC患者86例，为宁德市闽东医院肝胆外科2009年—2014年手术切除、病理科存档石蜡标本，所有患者在手术前均未接受化疗和放疗。其中男56例，女30例；年龄35~74岁，中位年龄50岁。根据Edmondso四级分级法，将HCC分为Ⅰ~Ⅳ级，Ⅰ、Ⅱ级为高分化，Ⅲ、Ⅳ级为低分化。其中，高分化56例，低分化30例；肿瘤直径＜5 cm 48例，直径≥5 cm 38 例；AFP （ng/ml）≥20 ng/ml 58例，AFP（ng/ml）<20 ng/ml 28例；配对的癌旁组织86例，取距肿瘤病灶边缘至少2 cm以外肝组织。

另收集宁德市闽东医院肝胆外科2014年—2015年手术切除的新鲜肝癌组织标本30例。HCC患者术前未接受其他治疗措施，HCC组织标本均经术后病理学确诊为原发性HCC，配对的癌旁组织取至距肿瘤边缘至少2 cm以外肝组织。组织标本离体后立刻存储于液氮，并记录患者临床信息，如年龄、性别、组织学分级、AFP水平等。样品采集遵循法律和伦理委员会准则，并取得患者知情同意。

1.2主要仪器与试剂 高速冷冻离心机（Eppendorf，德国）；PCR 仪（Eppendorf，德国）；Bio-Rad 电泳系统 （Bio-Rad，美国）；凝胶成像系统（Bio-Rad，美国）；荧光定量 PCR 仪（Roche 480）；Trizol（Invitrogen，美国）；RNase-free 水（Takara，中国大连）；2×Taq PCR MasterMix（全式金，北京）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（Takara，中国大连）；SYBR○RPremix Ex TaqTMII （Tli RNase HPlus），Bulk（Takara，中国大连）；BCA 定量试剂盒（凯基生物，南京）；ACY-1 抗体（abcam，美国）；抗β-actin 单克隆抗体（Sigma，美国）。

1.3方 法

1.3.1引物的设计与合成 根据文献设计引物序列并由上海生工生物工程公司合成。具体引物序列如下：β-actin上游引物 5'-TTGTTACAGGAAGTC CCTTGCC-3'，β-actin 下游引物 5'-ATGCTATCAC CTCCCCTGTGTG-3'；ACY-1上游引物 5'-GGCTG CATGAGGCTGTGTT-3'，ACY-1下游引物 5'-CTT GGCACTGGTTGGGATG-3'。

1.3.2RNA的提取与反转录 取标本50 mg，加入液氮研磨成粉末，Trizol裂解后继续不断研磨至液体。经氯仿分层、异丙醇沉淀及75%乙醇溶液洗涤干燥后，用适量DEPC水溶解RNA沉淀。取1 μl溶液用NanoDrop 1000超微量分光光度计测RNA浓度及纯度，然后进行cDNA的合成和RNA的电泳。按照TaKaRa试剂盒的操作步骤去基因组DNA后进行反转录。配制反转录反应体系，模板RNA 1 μl加入反应体系后，37 ℃孵育 15 min，85℃孵育5 min。反转录产物置于-20℃。

1.3.3实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR利用SYBR○RGreen qPCR进行检测，β-actin为内参。反应体系为：20 μl：Ex Taq（2×）10 μl，PCR Forward Primer （10 μM）0.8 μl，PCR Reverse Primer（10 μM）0.8 μl，DNA 模板 2 μl，ddH2O 6.4 μl。反应设三复孔。反应条件：预变性95℃ 30 sec；PCR 95℃ 5 sec，60℃ 30 sec，45 个循环；融解 95℃5 sec，60 ℃ 1 sec；降温 50 ℃ 30 sec。 利用 2-△△Ct法计算分析ACY-1mRNA相对表达量。

1.3.4蛋白提取 取大约300 mg样本，研磨后，按1∶5（V/W）的比例加入含有1×蛋白水解酶抑制药的TBS （Tris HCl 50 mmol/L pH7.4；EDTA 2 mmol/L；NaCl 150 mmol/L），将匀浆液超声破碎处理3 min。然后，加入等体积含1×蛋白酶抑制药的0.2%十二烷基硫酸钠溶液（SDS），4℃12 000 rpm离心1 h，收集上清并分装后于-80℃保存。

1.3.5蛋白浓度测定 利用BCA Protein Assay Kit进行蛋白浓度测定，配置工作液，稀释标准品至不同浓度梯度，同时稀释ACY-1蛋白样本10倍待用。将样品及标准品加入96孔板后加入工作液，65℃孵育30 min后，酶标仪测定A562 nm，根据标准曲线计算蛋白浓度。

1.3.6Western blot分析 灌制分离胶和浓缩胶，加电泳缓冲液后上样，电泳后将蛋白转印于NC膜。3%脱脂奶粉封闭后加入一抗：ACY-1抗体（1∶5000）和 β-actin 抗体（1∶5000）；4 ℃过夜后洗膜，加入二抗37℃孵育1 h。洗膜后加入ECL显影，用凝胶图像分析仪扫描照片。最后用image-plus软件测量灰度值做统计分析。

1.3.7免疫组化分析 肝组织标本经10%福尔马林固定、石蜡包埋后制片；免疫组织化学以SP法进行。DAB显色，苏木素复染后封片。在高倍镜下随机选取5个视野，当胞质棕黄色染色强度高于背景非特异染色时判断为阳性染色细胞。

1.3.8统计学分析 采用SPSS统计软件分析处理数据，各组数据以（x±s）表示。采用方差分析比较各组之间的差异显著性，并进行等级相关分析，p＜0．05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1ACY-1 mRNA和ACY-1蛋白在HCC组织中的表达 利用qRT－PCR检测30对肝癌组织及配对癌旁组织中ACY－1 mRNA的表达水平，结果显示：肝癌组织中ACY－1 mRNA的表达水平明显低于配对癌旁组织 （图1）。同时，又利用Western blot方法检测了8对肝癌组织及配对癌旁组织中ACY－1的表达水平，并采用Image J图像分析软件扫描测定光密度值，而后与内参β－actin光密度值相比，得出相对值（图2）。结果表明：肝癌组织中ACY－1蛋白表达水平也明显低于配对癌旁组织。

图1　HCC组织及配对癌旁组织中ACY-l mRNA的表达

图2　Western Blot检测ACY-l蛋白在HCC组织及配对癌旁组织中的表达

2.2免疫组化分析HCC组织中ACY-1的表达利用免疫组化方法检测86对HCC组织及其配对癌旁组织中ACY－1蛋白的表达。ACY－1蛋白阳性表达为黄色或棕黄色颗粒，根据阳性细胞比例和染色强度计分，将肝癌组织分为ACY－1高表达组（评分“强”）和低表达组（评分“弱”或“中”）。结果发现：HCC组织中ACY－1表达阳性率低于癌旁组织且具有显著差异，这与Western Blot结果一致（图3）。另外，分析ACY－1蛋白表达水平与HCC患者的临床病理参数之间的相关性发现，ACY－1蛋白表达水平与AFP水平密切相关，但与患者年龄、性别、肿瘤大小、组织分化程度、HBV感染因素无关（表1）。

图3　免疫组化检测ACY-1蛋白在HCC组织和癌旁组织中表达

表1　ACY-1蛋白表达与HCC临床病理特征关系

3　讨论

肝细胞癌（HCC）是一种常见的恶性肿瘤，死亡率位居世界恶性肿瘤的前三位，其发病率高，恶性程度高，浸润和转移性强，预后差。我国是肝癌的高发国家，HCC死亡人数约占世界的1/2以上，究其原因之一是患者未能尽早发现并及时治疗，不同分期的HCC疗效和预后有很大的差异。成人肝细胞受损时，肝干细胞可分化为肝细胞和胆管细胞，而干细胞的子代有合成AFP的能力，也有发展为肿瘤细胞的可能性，故AFP广泛应用于HCC的普查和诊断，是一种特异的筛查和诊断HCC的肿瘤标志物，它与影像学检查相结合可以早期发现 HCC。正常人血清AFP参考值为0～7 ng/ml，临床上一般以20 ng/ml作为评价标准。

一部分肝炎或肝硬化患者AFP轻度升高，但一般不会超过200 ng/ml［10］。肝硬化是肝癌发生的主要病因。如以AFP＞20 ng/ml为标准，急性肝炎、慢性肝炎和肝硬化的AFP阳性率分别为31%～52%、5%～58%和11%～47%。血清AFP为400 ng/ml是HCC的临界值。当AFP介于20～400 ng/ml时，若连续监测有持续升高的趋势，对HCC的诊断也有价值［11］。虽然AFP在肿瘤的早期筛查和治疗中有重要的作用，但仍有30%～40%的HCC患者的AFP阴性，并且近年来AFP阴性或低滴度AFP的HCC患者逐渐增多；另外病毒性肝炎活动期或肝硬化等因素也会导致 AFP 假阳性［12，13］。因此，寻找特异性的 HCC生物学标志物或特定的治疗靶点对HCC的治疗及预后有着重要意义。

ACY－1是一种广泛分布于各种组织的胞质酶，主要参与生物体内氨基酸代谢，专一水解N－酰基－L－氨基酸的酰胺键形成L－氨基酸，而L－氨基酸参与机体代谢过程，具有生理活性。遗传性ACY－1表达缺失会造成代谢异常，从而导致神经系统症状。ACY－1在许多肿瘤疾病，如小细胞肺癌，肾细胞癌，直肠癌及神经母细胞瘤中的表达都被广泛报道［14］，在肺癌和肾癌中ACY－1被报道为一种抑癌基因，但其在肝癌中鲜有报道。肿瘤组织中ACY－1表达水平与肿瘤TNM分期、淋巴结转移和血管侵犯密切相关。肾癌中，利用小干扰RNA技术沉默ACY－1表达后，HCT116细胞增殖能力减弱，凋亡细胞比例增加。ACY－1可以被分泌到外周血中，但大部分的肾移植受者在移植前及后的血清中ACY－1很难被检测到。而高达65%的发生移植肾功能延迟恢复的移植受者，血清中的ACY－1会显著升高，因此ACY－1可以作为肾移植长期预后评判的重要血清标志物。这提示，ACY－1也可能同样有作为HCC血清分子标志物的潜在应用价值。

该研究结果显示，相对于配对癌旁组织，HCC组织中的ACY－1 mRNA表达下调。同mRNA表达趋势一致，Western Blot结果也表明，ACY－1蛋白在肝癌中的表达低于癌旁组织。这与之前在小细胞肺癌和肾癌中的报道一致［15］，但与ACY－1在结直肠癌中的报道不同。结直肠癌组织中ACY－1的表达则上调，而ACY－1在结直肠癌组织中的高表达预示着结直肠癌患者的预后不良。ACY－1的缺失可能参与了肝癌发生发展并起到促进作用。有研究报道，ACY－1可以联合CD34和泛素样结合蛋白p62（sequestosome 1）作为区分小肝细胞癌和增生性结节的潜在免疫组化标志物［10］。 另外，ACY－1联合sequestosome－1和glypican－3也可以区分高分化肝癌和增生性结节［10］。因此试验中结合免疫组化的方法，对手术切除、病理科存档的HCC患者石蜡标本中ACY－1蛋白的表达水平及其与临床病理参数之间的相关性进行分析，发现癌旁组织中ACY－1蛋白水平明显高于肝癌组织。与此同时，ACY－1蛋白的表达水平与血清中AFP的水平密切相关，但与患者年龄、性别、肿瘤大小、组织分化程度及HBV感染因素无关。提示不同年龄、不同性别的HCC组织中的ACY－1的表达没有特异性；同时ACY－1的表达与患者肿瘤大小、组织分化程度无关，提示其与肝癌进展情况及恶性程度无关。另外，由于AFP的阳性率只有60%左右，而在部分AFP正常（＜20 ng/ml）的HCC患者中也存在ACY－1基因的低表达，或许ACY－1作为肝癌肿瘤标志物的诊断价值需要以正常人群作为对照进行研究。

［1］ TORRE LA，BRAY F，SIEQEL RL，et al．Global cancer statistics，2012［J］．CA Cancer J Clin，2015，65（2）：87－108．

［2］ CHEN JG，ZHANG SW．Liver cancer epidemic in China：past，present and future［J］．Semin Cancer Biol，2011，21（1）：59－69．

［3］ KEW MC．Epidemiology of hepatocellular carcinoma［J］．Toxicology，2002，27（181/182）：35－38．

［4］ BOBER J，SAMEK P．Surgery of the tumours of the liver［J］．Bratisl Lek Listy，2002，103（11）：403－407．

［5］ MILLER YE，DRABKIN H，JONES C，et al．Human aminoacylase－1： cloning，regional assignment to distal chromosome 3p21．1，and identification of a cross－hybridizing sequence on chromosome 18［J］．Genomics，1990，8（1）：149－154．

［6］ MILLER YE，MINNA JD，GAZDAR AF．Lack of expression of aminoacylase－1 in small cell lung cancer．Evidence for inactivation of genes encoded by chromosome 3p［J］．J Clin Invest，1989，83（6）：2120－2124．

［7］ CALZADILLA P，GOMEZ－SERRANO M，GARCIA－SANTOS E，et al．N－Acetylcysteine affects obesity－related protein expression in 3T3－L1 adipocytes［J］．Redox Rep，2013，18（6）：210－218．

［8］ SASS JO，OLBRICH H，MOHR V，et al．Neurological findings in aminoacylase 1 deficiency［J］．Neurology，2007，68（24）：2151－2153．

［9］ MITTA M，MIYAQI M，KATO I，et al.Identification of the catalytic triad residues of porcine liver acylamino acid-releasing enzyme［J］.J Biochem，1998，123（5）：924-931.

［10］ THOMAS RL，Blakemore KJ.Evaluation of elevations in maternal serum alpha-fetoprotein：a review［J］.Obstet Gynecol Surv，1990，45（5）：269-283.

［11］ WANG ZS，GUO WD，WU LQ，et al.Use of Cytokeratin-19 concentration to assess early recurrence and prognosis of hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma following radical resection in patients with a low serum alpha-fetoprotein concentration［J］.PLoS One，2015，10（11）：e0142727.

［12］ MALUCCIO M，COVEY A.Recent progress in understanding，diagnosing，and treating hepatocellular carcinoma［J］.CA Cancer J Clin，2012，62（6）：394-399.

［13］ HSU CY，HSU CY，LIU PH，et al.Using serum alpha-fetoprotein for prognostic prediction in patients with hepatocellular carcinoma： what is the most optimal cutoff?［J］.PLoS One，2015，10（3）：e0118825.

［14］ WEI X，XIE H，LINQ Q，et al.Proteomics-based identification of the tumor suppressor role of aminoacylase 1 in hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Lett，2014，351（1）：117-125.

［15］魏绪勇.ACY1在肝细胞肝癌中的表达及作用机制研究［D］.杭州：浙江大学，2015.